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《質(zhì)粒DNA的提取及電泳檢測(cè).pdf》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫。
1、實(shí)驗(yàn)質(zhì)粒DNA的提取及電泳檢測(cè)一實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^本實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)掌握堿裂解法提取細(xì)菌質(zhì)粒DNA。二實(shí)驗(yàn)原理1.細(xì)菌中有兩種DNA，即染色體DNA和質(zhì)粒DNA。2.質(zhì)粒DNA的提取方法有三種：堿裂解法，煮沸法，去污劑（如Triton和SDS）裂解法。3.堿裂解法比較劇烈，可破壞堿基配對(duì)，使宿主細(xì)胞DNA變性，共價(jià)閉合環(huán)狀DNA由于空間纏繞，兩條鏈不會(huì)徹底分開。當(dāng)外界條件到達(dá)復(fù)性條件時(shí)，質(zhì)粒DNA的雙鏈又迅速恢復(fù)原狀，而較大的線性染色體DNA難以復(fù)性。三實(shí)驗(yàn)材料：轉(zhuǎn)化后的細(xì)菌(含有質(zhì)粒的大腸桿菌)四、實(shí)驗(yàn)用具和藥品1.實(shí)驗(yàn)用具:搖床
2、，離心機(jī)，移液器及槍頭，玻璃試管（15mL）及塞子，離心管（1.5mL）2.實(shí)驗(yàn)試劑：（1）溶液I50mmol/L葡萄糖25mmol/L三羥甲基氨基甲烷（Tris）Tris·HCl（pH8.0）10mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA）（pH8.0）（2）溶液II0.4mol/LNaOH，2%SDS，用前等體積混合（3）溶液III5mol/L乙酸鉀60ml冰乙酸11.5ml水28.5ml（4）TE緩沖液10mmol/LTris·HCl（pH8.0）1mmol/LEDTA（pH8.0）（5）70%乙醇（放-20℃冰箱中，用
3、后即放回）（6）加樣緩沖液（6X）：40%蔗糖、0.25%溴酚蘭（7）電泳緩沖液：0.045mol/LTris-硼酸0.001mol/LEDTA（0.5XTBEbuffer）電泳緩沖液貯存液：5X：54gTris堿、27.5g硼酸、20ml0.5mol/LEDTA（pH8.0）五實(shí)驗(yàn)步驟（一）細(xì)菌繁殖挑取白色的單菌落若干，轉(zhuǎn)移到3mL液體LB培養(yǎng)基(附加100mg/mlAmp),37℃過夜振蕩（200r/min）培養(yǎng)。（二）菌體收集將過夜培養(yǎng)的菌體轉(zhuǎn)入1.5mL離心管，離心30sec5000r/min；棄上清提取質(zhì)粒（
4、三）質(zhì)粒提取方法一：堿裂解法提取質(zhì)粒DNA1．.將上述沉淀重懸于250μL冰預(yù)冷的溶液Ⅰ中，劇烈震蕩；2．加入250μL溶液Ⅱ，蓋緊管口，快速顛倒離心管5~10次；3．加入350μL冰預(yù)冷的溶液Ⅲ，蓋緊管口，溫和地顛倒離心管5~10次；9000r/min離心5min上清轉(zhuǎn)移到另一新1.5mL離心管中；4．加等體積氯仿，振蕩混合，靜置，9000r/min離心5min，上清轉(zhuǎn)移到另一新1.5mL離心管中；5．加入1/10體積3mol/L的醋酸鈉和2倍體積的乙醇，充分混勻，靜置5min；9000r/min離心5min；6．棄
5、上清，用70％ethanol洗滌；7．加30μLTE溶解，-20℃保存。方法二：試劑盒提取方法1.離心收集的菌體中加入含RNAase的溶液Ⅰ250μL，重懸菌體，不應(yīng)留有小的菌塊；2.加溶液Ⅱ250μL，輕輕顛倒離心管4-6次，使菌體充分裂解，至溶液澄清；3.加入350μL冰預(yù)冷的溶液Ⅲ，溫和并充分地上下翻轉(zhuǎn)混合6-8次；4.12000r/min離心10min；5.將上清轉(zhuǎn)移到DNA結(jié)合管（置于2ml離心管中），12000r/min離心1min，棄濾液；6.將制備管置回離心管，加入去蛋白試劑500μL，12000r/m
6、in離心1min，棄濾液；7.將制備管置回離心管，加洗滌液700μL，12000r/min離心1min，棄濾液；以同樣的方法再用700μL洗滌液洗滌一次，棄濾液。8.將制備管置回2ml離心管中，12,000×g離心1min，去除殘余的洗滌液；10將DNA結(jié)合柱放入另一個(gè)新的1.5mL離心管中，在制備管膜中央加60-80μL洗脫液或去離子水，室溫靜置1min。12,000×g離心1min。（四）檢測(cè)提取DNA質(zhì)量的電泳檢測(cè)。取4ul質(zhì)粒DNA+2ul加樣緩沖液+6ulddH2O；配制1%的瓊脂糖凝膠電泳30min，EB染
7、色，拍照。注意事項(xiàng)：氯仿對(duì)眼睛、皮膚、粘膜及呼吸道都有刺激作用，它是致癌劑并可損傷肝臟和腎臟，操作時(shí)需戴手套、口罩。六實(shí)驗(yàn)作業(yè)1.思考本實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵步驟是什么？2.瓊脂糖電泳鑒定質(zhì)粒DNA時(shí)，能看到幾條帶，快慢順序是什么？3.附上電泳圖片。（注：專業(yè)文檔是經(jīng)驗(yàn)性極強(qiáng)的領(lǐng)域，無法思考和涵蓋全面，素材和資料部分來自網(wǎng)絡(luò)，供參考?？蓮?fù)制、編制，期待你的好評(píng)與關(guān)注）
