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1、《江西畜牧獸醫(yī)雜志》2014年第6期·實驗研究·文章編號：1004-2342（2014）06-0011-03中圖分類號+：S852.659.6文獻標識碼：B豬流行性腹瀉病毒部分S1基因克隆*王蓓，陳如圣，孫明，張祥華，潘美慧，熊加明，鄔向東，何后軍，陳瑞光（江西農(nóng)業(yè)大學動科院，江西南昌330045）摘要：為研究江西省PEDV流行株可能的變異情況，作者采用RT-PCR成功擴增了PEDV的部分S1基因，并將其克隆至T載體，經(jīng)測序同源性分析，與PEDV標準毒株同源性在95%以上，說明成功的克隆了PEDV病毒部分S1基因，為將來進一步研究打下基礎。關鍵詞：豬流行性腹瀉；分子流行
2、病學調查；同源性豬流行性腹瀉病毒（PorcineEpidemicDiarrhea毒性腹瀉仔豬的小腸組織及糞便樣品。Virus,PEDV）是引發(fā)豬流行性腹瀉（PorcineEpi－1.1.2主要設備。K960型梯度PCR擴增儀，5415RdemicDiarrhea,PED）的原因。其屬于冠狀病毒科，型eppendorf高速臺式冷凍離心機，JY300C型電泳[1]冠狀病毒亞科甲型冠狀病毒屬b亞群。PED對于儀、JY02S型紫外分析系統(tǒng)，SPX-150B-Z型上海博不同年齡段及不同品種的豬都容易感染，是豬的一迅生化培養(yǎng)箱，DW-FL262型-40℃中科美菱超低溫種擁有高度接觸
3、性的傳染病，以哺乳仔豬最為嚴冷凍儲存箱等。重，死亡率可達100%，該病在我國及世界各養(yǎng)豬國1.1.3主要試劑。氨芐青霉素、LB培養(yǎng)基、SDS、Tris家普遍分布。其主要的臨床癥狀以食欲不振、水樣堿等（Solarbio公司產(chǎn)品）；EcoRⅠ、SalⅠ、PCRmix、腹瀉、嘔吐、脫水，最后酸中毒為基本特征。以往該M-MLV逆轉錄酶、RNA酶抑制劑、dNTP等（普洛麥病雖給養(yǎng)豬業(yè)造成了極其嚴重的影響，但病毒感染格公司）；TrizolKit、DNA凝膠回收純化Kit與[2]往往在一周后即基本恢復，病程較短。但最近幾PMD18-TVector（大連寶生公司）。年，該病在我國發(fā)生率
4、明顯升高，而且病程拖長，給1.2方法[3]養(yǎng)豬場造成極其嚴重的損失。本研究根據(jù)NCBI發(fā)1.2.1PEDV部分S1基因的RT-PCR擴增方法建立表的PEDV標準毒株序列設計引物，通過RT-PCR1.2.1.1引物設計。根據(jù)GenBank上已發(fā)表PEDV-S方法，擴增出預期大小基因片段，經(jīng)克隆測序，證實基因序列設計引物，預期大小為1139bp，由上海生本研究成功克隆到PEDV-S1基因，為進一步研究工生物工程公司合成。引物序列：其變異性提供了理論基礎。P1：5'-------TTCACTGGTCATGGCACTGAC1材料與方法--------3'1.1材料P2：5'--
5、-----CTAACAGGCGTGTTGTAAAGC1.1.1病料來源。采集江西省南昌市某縣豬場疑似病TG----3'1.2.1.2病毒RNA的提取。取約50mg病料，加入有基金項目：2012年江西省大學生創(chuàng)新訓練項目（DC201313）；1mL生理鹽水的勻漿器中充分研磨后，12000×g離南昌市科技支撐項目（201-KJZC-NY-002）心3min，取上清用于總RNA提取。作者簡介：王蓓，女，江西農(nóng)業(yè)大學動醫(yī)專業(yè)學生，E-1.2.1.3PEDV反轉錄反應體系。無菌2H2O4.5μL、mail：1106269656@qq.comdNTP4μL、5×buffer4μL、
6、P21μL、RNA酶抑制0.5*通訊作者：鄔向東，副教授，E-mail：dxywxd2006@126.com。μL、M-MLV1μL、RNA模板5μL。反應條件：42℃·11·《江西畜牧獸醫(yī)雜志》2014年第6期·實驗研究·50min，72℃15min，獲得cDNA置-40℃冰箱保存?zhèn)溆?。培養(yǎng)12~16h。再將新鮮生長的轉化菌落轉接至LA[4]1.2.1.4RT-PCR退火溫度確定。反應條件：94℃預變液體培養(yǎng)基，參照分子克隆實驗指南堿裂解法提性5min；94℃45s，56.3℃、57.1℃、57.9℃、59.0℃、60.0℃、取轉化質粒。EcoRⅠ和SalⅠ雙酶切鑒定
7、重組質粒，61.1℃、62.2℃、63.3℃、64.2℃9個梯度45s，72℃90s，酶切體系如下。共35個循環(huán)；最后72℃延伸10min。反應體系：無10×buffer1.0μL菌2H2O8.5μL、cDNA2μL、PCRmix12.5μL、P11EcoRⅠ1.0μLSalⅠ1.0μLμL、P21μL產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳觀察。質粒DNA4.0μL1.2.1.5RT-PCR反應敏感性檢測。將cDNA模板做ddH2O3.0μL610倍遞度稀釋，采用10~10倍稀釋樣品進行擴增，Total10.0μL以無菌2H2O做空白對照，用優(yōu)化后的R
