三七總皂苷對骨髓間充質(zhì)干細胞增殖和向心肌樣細胞分化的影響

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1、三七總皂苷對骨髓間充質(zhì)干細胞增殖和向心肌樣細胞分化的影響【摘要】觀察三七總皂苷（PNS）對大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞（MSCs）增殖和體外誘導(dǎo)其分化為心肌樣細胞的作用。【方法】采用骨髓細胞體外培養(yǎng)技術(shù)分離大鼠MSCs，以流式細胞儀檢測細胞表面標志；采用四甲基偶氨唑鹽（MTT）法觀察PNS對MSCs的增殖影響；采用第8代MSCs進行體外心肌細胞誘導(dǎo)分化；采用相差顯微鏡、免疫組化及逆轉(zhuǎn)錄含酶鏈反應(yīng)（RTPCR）鑒定心肌細胞?！窘Y(jié)果】大鼠MSCs細胞表面抗原CD44陽性，CD34陰性；經(jīng)PNS作用后MSCs增長速度比空白對照組明顯加快，體外誘導(dǎo)后細胞形態(tài)發(fā)生變化，其細胞免疫組化呈結(jié)蛋

2、白（Desmin）、肌鈣蛋白(cTnI)陽性；RTPCR顯示誘導(dǎo)后細胞轉(zhuǎn)錄肌球蛋白重鏈mRNA水平增加?！窘Y(jié)論】PNS能促進大鼠MSCs體外增殖并可誘導(dǎo)MSCs分化為心肌樣細胞，為細胞移植治療心肌梗死提供了實驗依據(jù)?！娟P(guān)鍵詞】三七總皂苷/藥現(xiàn)象骨髓間充質(zhì)干細胞/病現(xiàn)象心肌梗死/中藥療法細胞培養(yǎng)心肌梗死后，如何促進心肌細胞的再生是心血管病學(xué)家面臨的一個難題。人們一直試圖尋找一種細胞移植材料以修復(fù)壞死心肌、改善心臟功能。近年來，干細胞的研究為人們提供了新的希望。骨髓間質(zhì)干細胞（mesemchymalstemcells,MSCs）是骨髓中除造血干細胞以外的另一類干細胞，具有向成

3、骨細胞、脂肪細胞、肌細胞等分化的能力［1］，并且在體外易于分離培養(yǎng)和擴增，這些特性使MSCs成為在細胞治療中有效發(fā)揮作用的理想細胞。目前國內(nèi)外多用5氮胞苷（5azacytidine，5aza）來誘導(dǎo)MSCs分化為心肌細胞，我們通過廣泛篩選，發(fā)現(xiàn)三七總皂苷（PanaxNotoginsengSaponins，PNS）可作為MSCs分化為心肌細胞的誘導(dǎo)劑，為心肌損傷的干細胞移植治療提供一種理想的細胞材料?，F(xiàn)報道如下。1材料與方法1.1材料1.1.1實驗動物純種7周齡SD大鼠，SPF級，雌雄不限，體質(zhì)量190g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供，合格證號：0004979。1.

4、1.2主要試劑與儀器IMDM（IscovesmodifiedDulberccosmedium）培養(yǎng)基購于Gibco公司；特級胎牛血清(FBS)購于Hyclone公司；5氮胞苷購于Sigma公司；PNS（批號：0870-200303）購于廣州市藥檢所（純度99％）；Percoll梯度分離液購于Pharmacia公司；熒光標記抗大鼠抗體CD34FITC、CD44FITC和小鼠抗人結(jié)蛋白抗體（Desmin）單抗、小鼠抗人肌鈣蛋白I（cTnI）單抗購于SantaCruz公司；鏈霉親含素-生物素復(fù)合物（SABC）試劑盒及二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色劑購于武漢博士德公司；Tri

5、zol為Gibco公司產(chǎn)品；聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）引物由上海申能博彩生物科技有限公司合成；AccessRTPCR試劑盒為Promega公司產(chǎn)品；倒置顯微鏡（日本，OLYMPUS）；CO2培養(yǎng)箱（美國力高公司）；流式細胞儀（美國BECKMANCOULTER）；PCR基因擴增儀（美國PE9600）。1.2方法1.2.1MSCs的分離與培養(yǎng)參照DM培養(yǎng)液沖出骨髓，用吸管吹打制成細胞懸液，并移入離心管中，1000r/min離心10min；棄上清及脂肪層，收集沉淀物用完全培養(yǎng)基（含IMDM、體積分數(shù)為10％FBS、100mg/L青霉素、100mg/L鏈霉素）充分混勻，加入含1.0

6、73g/mL的Percoll分離液的離心管內(nèi)，1500r/min離心20min；重復(fù)上一操作，收集中間云霧狀的單核細胞層，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌后，用完全培養(yǎng)基接種于25mL培養(yǎng)瓶中，并標記為P"1，置37℃含體積分數(shù)5%CO2的孵箱中進行原代培養(yǎng)。在培養(yǎng)的第4天進行首次換液。在相差顯微鏡下觀察細胞生長情況。1.2.2MSCs的傳代及純化參照Pittenger［3］的方法并加以改進：待原代培養(yǎng)的細胞增殖近整個培養(yǎng)瓶的底面時，用胰酶消化細胞后，用培養(yǎng)液中止消化并反復(fù)吹打貼壁細胞，制成單細胞懸液，按1：3傳代培養(yǎng)，并標記為P2，以后每天觀察細胞的生長情況，直至貼壁細胞彼此融

7、合鋪滿瓶底時，重復(fù)上述操作，反復(fù)傳至第8代。1.2.3MSCs的鑒定取第3代MSCs，胰酶消化后，加入熒光標記的抗CD34、CD44抗體，4℃孵育30min，以多聚甲醛固定，采用FACScan流式細胞儀檢查細胞表面抗原CD34和CD44。1.2.4PNS對MSCs增殖的影響取生長良好的第4代MSCs，胰酶消化后吹散，細胞計數(shù)后調(diào)整濃度至1×104/mL，加入96孔板，每孔200μL，37℃，體積分數(shù)5%CO2飽和濕度標準環(huán)境下以誘導(dǎo)培養(yǎng)液孵育24h后，去培養(yǎng)液及未貼壁的細胞。實驗組分別加入終濃度含PNS為50、10