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《基于rt-pcr方法檢測(cè)新甲型h1n1流感病毒》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫(kù)。
1、基于RT-PCR的方法檢測(cè)新的甲型H1N1流感病毒一、目的對(duì)采集的可疑病例標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，篩選甲型H1N1流感病毒并排除季節(jié)性H1N1流感病毒。二、引物NIC引物引物名稱(chēng)堿基組成目的片段大小備注FluAFluA-M-F30TTCTAACCGAGGTCGAAACG235bp甲型流感病毒M基因通用檢測(cè)引物FluA-M-R264ACAAAGCGTCTACGCTGCAGH1HAH1F1147AAGAGCACACATAATGCCAT527bpH1N1亞型檢測(cè)通用引物H1R1673CCATTRGARCACATCCAGHuH1HAH1HAF768ACTACTGGAC
2、TCTGCTGGAAC327bp人季節(jié)性流感病毒H1N1亞型檢測(cè)引物H1HAR1094CAATGAAACCGGCAATGGCTCCSWH1HA-1SW-H1F786AATAACATTAGAAGCAACTGG153bp此次甲型H1N1亞型流感病毒引物SW-H1R920AGGCTGGTGTTTATRGCACCRnasePRnasePFAGATTTGGACCTGCGAGCG約80bp與real-timePCR中RnaseP引物一致RnasePRGAGCGGCTGTCTCCACAAGT三、材料及儀器1、RNA提取試劑盒QIAGenRNeasyMiniKit（
3、catalog#74104）2、β－巰基乙醇（SIGMAβ-MercaptoethanolLot062K0115）3、70%乙醇4、RT-PCRKit：QIAGENOnestepRT-PCRKit（catalog#210212）5、RNasinRibonucleaseInhibitor（Promegacatalog#N2111）6、檢測(cè)引物7、Axygen1.5mL離心管，貨號(hào)：MCT-150-C8、Axygen0.2mLPCR管，貨號(hào)：PCR-02-C9、Axygen10μL，100μL，200μL，1000μL帶濾芯槍頭10、10μL，100μL
4、，200μL，1000μL加樣器11、可調(diào)轉(zhuǎn)速14K離心機(jī)：12、旋渦混合器：13、生物安全柜：二級(jí)生物安全柜14、PCR儀：15、瓊脂糖：BiowestAgaroseDistributedbyGeneTech（Shanghai）CompanyLimitedLotNo.10168516、核酸染料：17、電泳液：5×TBE電泳緩沖液catNo.9009032718．電泳槽、電泳儀四、實(shí)驗(yàn)步驟（一）RNA提取1、根據(jù)標(biāo)本數(shù)量分裝RLT液：從Kit中取出RLT液，用1.5mL離心管分裝，每管500μL（在體系配制區(qū)操作）。2、在生物安全柜內(nèi)將采樣液（鼻拭子
5、、咽拭子、胸水等）或病毒培養(yǎng)物（雞胚尿囊液或細(xì)胞培養(yǎng)液）取100μL加入RLT液管中，充分混勻。3、每管分別加入5μLβ-巰基乙醇，混勻后依次加入600μL70%的乙醇，充分混勻。4、從Kit中取出帶濾柱的2mL收集管，打開(kāi)包裝將其做好標(biāo)記。取步驟（3）中的混合液600μL加入濾柱中，12000rpm，離心15s，棄收集管中的離心液。5、濾柱仍放回收集管上，將步驟（3）剩余的混合液全部吸入濾柱中，12000rpm，離心15s，棄離心液。6、于濾柱中加入700μLWashBufferRW1液，12000rpm，離心15s。7、從QIAGENRNeasy
6、MiniKit中取一支干凈的2mL收集管，將離心后的濾柱移到新的收集管上，于濾柱中加入500μLWashBufferRPE液，12000rpm，離心15s。8、棄收集管中的離心液，再于濾柱中加入500μLWashBufferRPE液，13000~14000rpm，離心2min。9、將濾柱移到一個(gè)干凈的1.5mLeppendorf管上，向?yàn)V柱中加入30~50μL的Rnase-freeWater，室溫靜置1~3min。10、12000rpm，離心1min，收集離心液即為提取的病毒RNA，立即做實(shí)驗(yàn)或-20℃以下保存。注意：BufferRPE使用之間加44
7、mL無(wú)水乙醇。（二）反應(yīng)體系配制1、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：檢測(cè)標(biāo)本RNA質(zhì)控參數(shù)：陰性對(duì)照：無(wú)菌水（標(biāo)本RNA提取時(shí)，跟標(biāo)本同時(shí)提取無(wú)菌水。）陽(yáng)性對(duì)照：已知病毒RNA2、PCR反應(yīng)體系配制（在體系配制區(qū)配反應(yīng)液）1）按下表加入試劑：PCR反應(yīng)體系組分體積（μL）RNaseFreeWater5×RT-PCRBuffer11.9×n5×n10mMdNTPMixture1×nEnzymeMix1×nRNaseInhibitor0.1×n上游引物0.5×n下游引物0.5×nTotal20×n對(duì)每一個(gè)建立的反應(yīng)確定反應(yīng)數(shù)（n=擬進(jìn)行的PCR管數(shù)，包括陰性，陽(yáng)性對(duì)）?？紤]到
8、陰性無(wú)模板對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照，誤差，制備過(guò)量的反應(yīng)混合物是必要的。具體如下：（1）如果包括對(duì)照，樣品的數(shù)量（n）
