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《活體動物光學(xué)成像技術(shù)與應(yīng)用研究》由會員上傳分享,免費在線閱讀,更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、活體動物光學(xué)成像技術(shù)與應(yīng)用研究 摘要:活體動物光學(xué)成像是利用生物發(fā)光及熒光技術(shù)在活體動物體內(nèi)進(jìn)行生物標(biāo)記通過光學(xué)成像系統(tǒng)來監(jiān)測被標(biāo)記動物體內(nèi)分子及細(xì)胞等的生物學(xué)過程。按發(fā)光模式可分為生物發(fā)光和熒光兩類。相對于傳統(tǒng)動物實驗研究方法,具有無創(chuàng)、可多次重復(fù)、實時活體成像、靈敏、安全等優(yōu)勢,這項技術(shù)在標(biāo)記活體內(nèi)腫瘤活體細(xì)胞示蹤、標(biāo)記基因及轉(zhuǎn)基因動物等方面的應(yīng)用廣泛。關(guān)鍵詞:活體成像;生物發(fā)光;熒光;應(yīng)用傳統(tǒng)實驗設(shè)計動物研究時,常采用的方法是處死老鼠,解剖后通過肉眼觀察臟器病理變化,再組織切片觀察等,無法動態(tài)監(jiān)測整個活體內(nèi)生物學(xué)事件的
2、發(fā)生、發(fā)展,而活體動物光學(xué)成像(opticalinvivoimaging)9主要采用生物發(fā)光(bioluminescence)與熒光(fluorescence)2種技術(shù)在活體動物體內(nèi)進(jìn)行生物標(biāo)記,通過成像系統(tǒng)可以動態(tài)或靜態(tài)監(jiān)測被標(biāo)記分子或細(xì)胞在活體動物體等的發(fā)展進(jìn)程,以及觀測活體動物體內(nèi)腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移、感染性疾病發(fā)展過程、特定基因的表達(dá)等生物學(xué)過程[1-3]。生物發(fā)光是通過熒光素酶(Luciferase)基因標(biāo)記細(xì)胞或DNA,而熒光技術(shù)則采用熒光報告基因(GFP、RFP及dyes等)進(jìn)行標(biāo)記。兩者的主要區(qū)別在于生物發(fā)光是動物
3、體內(nèi)的自發(fā)熒光,不需要激發(fā)光源,而熒光則需要外界激發(fā)光源的激發(fā)出熒光再通過檢測器檢測,就可以直接觀察到被測物體內(nèi)的細(xì)胞運動和基因行為。1原理與分類活體動物光學(xué)成像技術(shù)是指在活體動物體內(nèi)利用報告基因-熒光素酶基因表達(dá)使其產(chǎn)生的熒光素酶蛋白再與小分子底物熒光素作用,需在氧、Mg2+存在的條件下消耗ATP之后發(fā)生氧化反應(yīng),這時將產(chǎn)生的化學(xué)能量轉(zhuǎn)化變?yōu)榭梢姽饽茚尫?,最后在體外再利用敏感的檢測器CCD設(shè)備形成圖像。熒光素酶基因可以被插入多種基因的啟動子(promoter),成為某種基因的報告基因,通過監(jiān)測報告基因從而實現(xiàn)對目標(biāo)基因的監(jiān)測
4、。1.1生物發(fā)光技術(shù)生物發(fā)光熒光實質(zhì)是一種化學(xué)發(fā)光,其過程需要底物螢火蟲熒光素酶的參與,通過氧化其特有底物的過程中,將會釋放可見光光子,其波長廣泛約為560nm(460~630nm),甚至包括超過600nm的重要的波長紅光范圍。在哺乳動物體內(nèi)吸收可見光的主要成分是血紅蛋白,能吸收中藍(lán)綠光波段的大部分可見光;吸收紅外線主要是水和脂質(zhì),但均對波長為590~800nm的紅光至近紅外線吸收能力較差,因此波長范圍在紅光超過6009nm的區(qū)域即使有部分散射消耗但大部分可以穿透哺乳動物組織被敏感的CCD檢測器檢測到。常用方法是構(gòu)建熒光素酶基
5、因表達(dá)載體轉(zhuǎn)染目標(biāo)細(xì)胞,并移植到受體靶器官中,觀察時注入外源熒光素,目標(biāo)細(xì)胞內(nèi)即可發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生熒光,通過活體動物光學(xué)成像系統(tǒng)(如IVISspectrum系統(tǒng))就可以檢測生物發(fā)光[4]。生物發(fā)光技術(shù)因為有著較高的靈敏度,最少可以檢測到小動物體內(nèi)102個細(xì)胞此外,還具有對環(huán)境變化反應(yīng)迅速、成像速度快、圖像清晰等優(yōu)點[5]。1.2熒光成像技術(shù)與生物發(fā)光不同,熒光發(fā)光不需要底物的參與,但需要外部的激發(fā)光源,利用激發(fā)光使熒光基團(tuán)(如綠色熒光蛋白、紅色熒光蛋白或者熒光染料)達(dá)到較高的能量水平,然后發(fā)射出波長較長的發(fā)射光[6]。熒光成像技術(shù)
6、的信號水平取決于發(fā)光細(xì)胞的數(shù)量及激發(fā)光的強(qiáng)度,光線穿過的組織對其有強(qiáng)烈的吸收,而且小動物的皮膚、毛發(fā)、軟骨和體內(nèi)的食物等都會產(chǎn)生熒光,將會對目標(biāo)信號產(chǎn)生干擾,因此熒光成像技術(shù)的敏感性較生物發(fā)光技術(shù)差,熒光強(qiáng)度會隨著目標(biāo)深度的增加而成遞減。但是熒光成像技術(shù)具有標(biāo)記靶點的多樣性、一次可以應(yīng)用不同的熒光基因標(biāo)記不同的細(xì)胞的優(yōu)勢,因而在進(jìn)行一些分子生物學(xué)以及小分子體內(nèi)代謝研究中得到了廣泛應(yīng)用[7]。2成像過程9活體動物光學(xué)成像系統(tǒng)一般由高靈敏度的低溫CCD相機(jī)、成像暗箱和成像軟件組成。一般成像過程是:小動物麻醉后放入成像暗箱平臺,也可
7、以同時檢測多只動物,只需要調(diào)整控制平臺升降到一個合適的視野,選擇合適的條件,對于熒光成像,需要選擇合適的濾光片,開啟激發(fā)光源,激發(fā)熒光物質(zhì)而發(fā)光,拍攝出背景圖與小動物體內(nèi)發(fā)出的光,將其疊加可以清晰地顯示活體內(nèi)發(fā)光情況,完成圖像采集。最后可以通過軟件對圖像進(jìn)行分析,當(dāng)選定需要測量的區(qū)域后,軟件可以計算出此區(qū)域發(fā)出的光子數(shù),獲得實驗數(shù)據(jù)[8]。3優(yōu)勢比較目前的活體生物體內(nèi)成像技術(shù),如超生(ultrasound)、計算機(jī)斷(ComputedTomography,CT)、核磁共振(MagneticTesonanceimaging,MR
8、I)、正電子衍射成像(Positron-EmissionTomography,PET)、單光子衍射(Single-Photon-EmissionComputedTomography,SPECT)等技術(shù),活體動物體內(nèi)光學(xué)成像具有許多獨特的優(yōu)勢:①無創(chuàng)性,②操作簡便,③測量快,④