活體動(dòng)物光學(xué)成像技術(shù)與應(yīng)用研究

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1、活體動(dòng)物光學(xué)成像技術(shù)與應(yīng)用研究　　摘要：活體動(dòng)物光學(xué)成像是利用生物發(fā)光及熒光技術(shù)在活體動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行生物標(biāo)記通過光學(xué)成像系統(tǒng)來監(jiān)測(cè)被標(biāo)記動(dòng)物體內(nèi)分子及細(xì)胞等的生物學(xué)過程。按發(fā)光模式可分為生物發(fā)光和熒光兩類。相對(duì)于傳統(tǒng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究方法，具有無創(chuàng)、可多次重復(fù)、實(shí)時(shí)活體成像、靈敏、安全等優(yōu)勢(shì)，這項(xiàng)技術(shù)在標(biāo)記活體內(nèi)腫瘤活體細(xì)胞示蹤、標(biāo)記基因及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物等方面的應(yīng)用廣泛?！　￡P(guān)鍵詞：活體成像；生物發(fā)光；熒光；應(yīng)用　　傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)動(dòng)物研究時(shí)，常采用的方法是處死老鼠，解剖后通過肉眼觀察臟器病理變化，再組織切片觀察等，無法動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)整個(gè)活體內(nèi)生物學(xué)事件的發(fā)

2、生、發(fā)展，而活體動(dòng)物光學(xué)成像（opticalinvivoimaging）主要采用生物發(fā)光（bioluminescence）與熒光（fluorescence）2種技術(shù)在活體動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行生物標(biāo)記，通過成像系統(tǒng)可以動(dòng)態(tài)或靜態(tài)監(jiān)測(cè)被標(biāo)記分子或細(xì)胞在活體動(dòng)物體等的發(fā)展進(jìn)程，以及觀測(cè)活體動(dòng)物體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移、感染性疾病發(fā)展過程、特定基因的表達(dá)等生物學(xué)過程[1-3]。生物發(fā)光是通過熒光素酶（Luciferase）基因標(biāo)記細(xì)胞或DNA，而熒光技術(shù)則采用熒光報(bào)告基因（GFP、RFP及dyes等）進(jìn)行標(biāo)記。兩者的主要區(qū)別在于生物發(fā)光是動(dòng)物體內(nèi)的自發(fā)熒光

3、，不需要激發(fā)光源，而熒光則需要外界激發(fā)光源的激發(fā)出熒光再通過檢測(cè)器檢測(cè)，就可以直接觀察到被測(cè)物體內(nèi)的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和基因行為?！　?原理與分類　　活體動(dòng)物光學(xué)成像技術(shù)是指在活體動(dòng)物體內(nèi)利用報(bào)告基因-熒光素酶基因表達(dá)使其產(chǎn)生的熒光素酶蛋白再與小分子底物熒光素作用，需在氧、Mg2+存在的條件下消耗ATP之后發(fā)生氧化反應(yīng)，這時(shí)將產(chǎn)生的化學(xué)能量轉(zhuǎn)化變?yōu)榭梢姽饽茚尫?，最后在體外再利用敏感的檢測(cè)器CCD設(shè)備形成圖像。熒光素酶基因可以被插入多種基因的啟動(dòng)子（promoter），成為某種基因的報(bào)告基因，通過監(jiān)測(cè)報(bào)告基因從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)基因的監(jiān)測(cè)?！　?.1生物

4、發(fā)光技術(shù)生物發(fā)光熒光實(shí)質(zhì)是一種化學(xué)發(fā)光，其過程需要底物螢火蟲熒光素酶的參與，通過氧化其特有底物的過程中，將會(huì)釋放可見光光子，其波長(zhǎng)廣泛約為560nm（460～630nm），甚至包括超過600nm的重要的波長(zhǎng)紅光范圍。在哺乳動(dòng)物體內(nèi)吸收可見光的主要成分是血紅蛋白，能吸收中藍(lán)綠光波段的大部分可見光；吸收紅外線主要是水和脂質(zhì)，但均對(duì)波長(zhǎng)為590～800nm的紅光至近紅外線吸收能力較差，因此波長(zhǎng)范圍在紅光超過600nm的區(qū)域即使有部分散射消耗但大部分可以穿透哺乳動(dòng)物組織被敏感的CCD檢測(cè)器檢測(cè)到。常用方法是構(gòu)建熒光素酶基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)染目標(biāo)細(xì)胞，

5、并移植到受體靶器官中，觀察時(shí)注入外源熒光素，目標(biāo)細(xì)胞內(nèi)即可發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生熒光，通過活體動(dòng)物光學(xué)成像系統(tǒng)（如IVISspectrum系統(tǒng)）就可以檢測(cè)生物發(fā)光[4]。生物發(fā)光技術(shù)因?yàn)橛兄^高的靈敏度，最少可以檢測(cè)到小動(dòng)物體內(nèi)102個(gè)細(xì)胞此外，還具有對(duì)環(huán)境變化反應(yīng)迅速、成像速度快、圖像清晰等優(yōu)點(diǎn)[5]?！　?.2熒光成像技術(shù)與生物發(fā)光不同，熒光發(fā)光不需要底物的參與，但需要外部的激發(fā)光源，利用激發(fā)光使熒光基團(tuán)（如綠色熒光蛋白、紅色熒光蛋白或者熒光染料）達(dá)到較高的能量水平，然后發(fā)射出波長(zhǎng)較長(zhǎng)的發(fā)射光[6]。熒光成像技術(shù)的信號(hào)水平取決于發(fā)光細(xì)胞的數(shù)量

6、及激發(fā)光的強(qiáng)度，光線穿過的組織對(duì)其有強(qiáng)烈的吸收，而且小動(dòng)物的皮膚、毛發(fā)、軟骨和體內(nèi)的食物等都會(huì)產(chǎn)生熒光，將會(huì)對(duì)目標(biāo)信號(hào)產(chǎn)生干擾，因此熒光成像技術(shù)的敏感性較生物發(fā)光技術(shù)差，熒光強(qiáng)度會(huì)隨著目標(biāo)深度的增加而成遞減。但是熒光成像技術(shù)具有標(biāo)記靶點(diǎn)的多樣性、一次可以應(yīng)用不同的熒光基因標(biāo)記不同的細(xì)胞的優(yōu)勢(shì)，因而在進(jìn)行一些分子生物學(xué)以及小分子體內(nèi)代謝研究中得到了廣泛應(yīng)用[7]。　　2成像過程　　活體動(dòng)物光學(xué)成像系統(tǒng)一般由高靈敏度的低溫CCD相機(jī)、成像暗箱和成像軟件組成。一般成像過程是：小動(dòng)物麻醉后放入成像暗箱平臺(tái)，也可以同時(shí)檢測(cè)多只動(dòng)物，只需要調(diào)整控制

7、平臺(tái)升降到一個(gè)合適的視野，選擇合適的條件，對(duì)于熒光成像，需要選擇合適的濾光片，開啟激發(fā)光源，激發(fā)熒光物質(zhì)而發(fā)光，拍攝出背景圖與小動(dòng)物體內(nèi)發(fā)出的光，將其疊加可以清晰地顯示活體內(nèi)發(fā)光情況，完成圖像采集。最后可以通過軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析，當(dāng)選定需要測(cè)量的區(qū)域后，軟件可以計(jì)算出此區(qū)域發(fā)出的光子數(shù)，獲得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)[8]?！　?優(yōu)勢(shì)　　比較目前的活體生物體內(nèi)成像技術(shù)，如超生（ultrasound）、計(jì)算機(jī)斷（ComputedTomography，CT）、核磁共振（MagneticTesonanceimaging，MRI）、正電子衍射成像（Positro

8、n-EmissionTomography，PET）、單光子衍射（Single-Photon-EmissionComputedTomography，SPECT）等技術(shù)，活體動(dòng)物體內(nèi)光學(xué)成像具有許多獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)：