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1、硫化砷誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡中Bcl┐2和Bax的表達(dá)論文.freelia，myeloid，chronicAbstract:AIMTostudytheexpressionandtheeffectsofBcl-2andBaxproteininapoptosisofK562cellinducedbyar-senicsulfide.METHODSAfterbeingincubatedinculturemediumcontainingvariablelevelsofarsenicsulfide，cellgroorphologybylighta
2、ndtransmissionelectronmicroscopy.TheexpressionofBcl-2andBaxproteininedmuno-histochemicalstainningandimaginganalysis.RESULTSAfterthetreatment，cellgroe-dependentmanner.Morphologically，aftertreatmentefeaturesofapoptosis.ThebaselineBcl-2expressionofK562cellent（A:0.138±0.02
3、8）（P0.05），buttheexpressionofBaxproteininK562cellsco-culturedaybecorrelateda公司.MTT溶液配制同文獻(xiàn)［8］.鼠抗人Bcl-2，兔抗人Bax均為MaximBiotech，Inc產(chǎn)品，UltraSensitiveTMS-PKit購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司.K562細(xì)胞是一種建株于慢性髓細(xì)胞白血病急性變患者骨髓細(xì)胞的細(xì)胞株［9］，將細(xì)胞以2×108L-1密度接種于含或不含藥物的新鮮RPMI1640完全培養(yǎng)液［內(nèi)含100mLL-1小牛血清（杭州四季青產(chǎn)），100×
4、103UL-1青霉素，100×103UL-1鏈霉素］中，在37℃、飽和濕度、含50mLL-1CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，隔日換液以保證細(xì)胞密度在（2～5）×108L-1.1.2方法1.2.1細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)不同濃度硫化砷溶液作用一定時(shí)間后，涂片，分別進(jìn)行TT法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖狀態(tài)將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞以2×108L-1密度接種于96孔板，試驗(yàn)組加入等體積含各濃度硫化砷的培養(yǎng)液，對(duì)照組加入等體積培養(yǎng)液，每組設(shè)4個(gè)平行孔，并各設(shè)空白孔（即只加入藥液和培養(yǎng)液，不加細(xì)胞）以調(diào)零.分別在培養(yǎng)18，42和70h后，加入MTT20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h
5、，離心，棄去上清，加入DMSO150μL，混勻，570nm處測(cè)A值.細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=（1-處理組A值/對(duì)照組A值）×100%.重復(fù)3次取平均值.1.2.3免疫組化檢測(cè)Bcl-2，Bax表達(dá)按照Ultra-SensitiveTMS-PKit說(shuō)明書(shū)操作.細(xì)胞滴片經(jīng)H2O2阻斷過(guò)氧化物酶活性后，以非免疫性動(dòng)物血清封閉，分別與一抗（鼠抗人Bcl-2，兔抗人Bax）室溫下孵育60min，先后與生物素標(biāo)記的二抗及鏈親和素-過(guò)氧化物酶孵育，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，光鏡下觀察.以上各步驟均在室溫下進(jìn)行，各步驟間均以pH7.4的PBS充分漂洗，每次染
6、色均設(shè)陰性及陽(yáng)性對(duì)照.結(jié)果用北航CMIAS真彩色病理圖像分析系統(tǒng)處理，用吸光度平均值（A）代表染色強(qiáng)度.2結(jié)果2.1細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察175～1400μgL-1硫化砷作用18～144h后，TT實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，硫化砷對(duì)K562細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖有明顯抑制作用，且此作用呈現(xiàn)明顯的劑量及時(shí)間依賴性（Tab1）.表1雄黃對(duì)K562細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的抑制率略2.3Bcl┐2和Bax的表達(dá)Bcl-2蛋白借其末端一個(gè)由19個(gè)氨基酸組成的疏水性羧基末端與膜相連，定位于細(xì)胞膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體膜及核膜上.免疫組化染色表明K562細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)很低，硫化砷處理
7、對(duì)其表達(dá)無(wú)明顯影響（Fig1）.圖像分析測(cè)陰性對(duì)照A值為:0.108±0.012，K562細(xì)胞Bcl-2蛋白基礎(chǔ)表達(dá)量A值為0.152±0.023，硫化砷處理后A值為0.138±0.028，無(wú)顯著性差異（P0.05）.Bax蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)，K562細(xì)胞經(jīng)硫化砷處理后，Bax染色強(qiáng)度明顯增加（Fig2）.圖像分析測(cè)定硫化砷處理前后，Bax蛋白表達(dá)量A值分別為0.240±0.013和0.316±0.021，差異顯著（P0.01）.3討論已有的研究發(fā)現(xiàn)CML發(fā)病與凋亡受抑有關(guān)［9，10］.我們發(fā)現(xiàn)，硫化砷在175μgL-1及以上濃度
8、時(shí)能抑制K562細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖并誘導(dǎo)其凋亡，說(shuō)明在一定劑量下，硫化砷可通過(guò)抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡而起作用.現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)許多基因與細(xì)胞凋亡有關(guān)，包括bcl-2家族、Apo-1/Fas（CD95）、c-myc、白細(xì)胞介素-1β轉(zhuǎn)化酶（ICE
