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1、棉花育性恢復基因的克隆與表達載體的構建1、相關定義1.1、RNAi的定義及特點RNA干擾(RNAinterference,RNAi)是近年來發(fā)展起來的新技術,已成為目前分子生物學研究中最活躍的熱點之一。它指由雙鏈RNA(double-strandedRNA,dsRNA)誘導的序列特異性的轉錄后基因沉默機制,能在多種生物中抑制特異基因的表達。RNAi所具有的特異性、穩(wěn)定性、高效、快速以及不改變基因組的遺傳組成等特性為人們研究未知功能的基因提供了新的反向遺傳學手段。在擬南芥和水稻等基因組測序完成后,RNAi這一新技術在植物功能基因組學研究及植物的遺傳改
2、良等方面提供了一個強有力的手段。隨著后基因組時代的到來,需要大規(guī)模高通量地研究基因的功能。RNAi技術作為一項快速、高效、便于操作的使靶基因失活的技術可以非常有效地鑒定特定基因的功能,表現(xiàn)出比反義和核酶等基因表達抑制技術更優(yōu)越的特性,因而正在成為功能基因組研究的有力工具。1.2、基因操作的基本概念和技術原理質粒:是一類在細菌細胞內發(fā)現(xiàn)的染色體外自主復制的環(huán)形雙鏈DNA分子,有些質粒還能整合到染色體基因組上面。載體:可以用來插入外源DNA片段構建重組DNA分子并導入寄主活細胞的質粒獲噬菌體統(tǒng)稱為基因克隆載體簡稱為載體[17]。克隆:在分子生物學中,帶
3、有一段DNA插入序列的一個寄主(載體單位)(例如細菌寄主中的重組質粒載體)。表達載體:一類按特殊要求設計構建的,具有調節(jié)外源基因表達的轉錄及轉譯控制信號的,并能使克隆基因在轉化的寄主細胞中得到有效表達的專門載體。大腸桿菌的表達載體可區(qū)分為表達型質粒載體和表達型噬菌體載體兩種類型。啟動子:位于基因上有的一段具有特殊功能的DNA序列,RNA聚合酶正是通過它的結合作用而啟動基因的轉錄。原核基因啟動子具有-10和-35等結構元件,而真核基因啟動子則具有TATA盒及上游元件等特征性結構[18]。轉化:細菌的轉化指細菌捕獲游離的DNA;并使此DNA編碼的遺傳信
4、息組入細菌染色體以成為永久遺傳組成部分;正常的真核細胞由于受到致瘤病毒的感染而轉變成惡性細胞的過程也叫做轉化;目前認為,凡外源DNA導入細胞的過程都可泛稱為轉化[19]。核酸的凝膠電泳基本原理:瓊脂糖是一種線性多糖聚合物,系從紅色海藻產(chǎn)物瓊脂中提取出來的。當瓊脂糖溶液加熱到沸點后冷卻凝固便會形成良好的電泳介質,其密度是由瓊脂糖的濃度決定的。經(jīng)過化學修飾的低熔點的瓊脂糖,在結構上4比較脆弱,因此在較低的溫度下便會熔化,可用于DNA片段的制備電泳。凝膠的分辨能力同凝膠的類型和濃度有關。瓊脂糖凝膠分辨DNA片段的范圍為0.2~50Kb之間;而要分辨小分子
5、量的DNA片段,則要用聚丙烯酰胺凝膠,其分辨范圍為1個堿基對到1000個堿基對之間。凝膠濃度的高低影響凝膠介質孔隙的大小,濃度越高孔隙越小,其分辨能力也越強;反之,濃度越低孔隙越大其分辨能力也越弱。例如,20%的聚丙烯酰胺凝膠分辨力可達1~6bpDNA小片段,而要分離1000bp的DNA片段,則要用3%的聚丙烯酰胺的凝膠。再如,2%的聚酯糖凝膠可分辨小到300bp的雙鏈DNA分子,而對于較大片段的DNA,則要用低濃度(0.3%~1.0%)的瓊脂糖凝膠。在凝膠電泳中,加入溴化乙錠染料對核酸分子染色之后,將電泳標本放置在紫外光下觀察,便可以十分敏感而方
6、便地檢測出凝膠介質中DNA的譜帶部位,即使每條DNA帶中僅含有0.05μg的微量DNA,也可以被清晰地顯示出來。這是因為溴化乙錠是一種具扁平分子的核酸燃料,可以插入到DNA獲RNA分子的堿基之間,并且在300nm波長的紫外光照下放射出熒光,所以可以用來顯現(xiàn)瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠中的核酸分子。PCR技術的基本原理及特點[20]:PCR技術快速敏感簡單易行,其原理并不復雜,與細胞內發(fā)生的DNA復制過程十分類似。首先,雙鏈DNA分子在臨近沸點的溫度下加熱時便會分離成兩條單鏈的DNA分子,然后DNA聚合酶以單練DNA為模版并利用反應混合物中的四種脫氧核
7、苷三磷酸合成新生的DNA互補鏈。此外,DNA聚合酶同樣需要有一小段雙鏈DNA來啟動新鏈的合成。因此,新合成的DNA鏈的起點,事實上是由加入在反應混合物中的一對寡核苷酸引物在模版DNA鏈兩端的退火位點決定的。這是PCR的第一個特點,及它能夠指導特定DNA序列的合成。在為每一條鏈均提供一段寡核苷酸引物的情況下,兩條單鏈DNA都可作為合成新生互補鏈的模版[21]。由于在PCR反應中所選用的一對引物,是按照與擴增區(qū)段兩端序列彼此互補的原則設計的,因此每一條新生鏈的合成都是從引物的退火結合位點開始,并沿著相反鏈延伸。這樣,在每一條新和成的DNA鏈上都具有新的
8、引物結合位點。然后反應混合物經(jīng)再次加熱使新、舊兩條鏈分開,并加入下輪的反應循環(huán),及引物雜交、DNA合成和鏈的分離。PCR反
