供者淋巴細(xì)胞輸注治療小鼠h22肝癌的實(shí)驗(yàn)研究論文

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1、供者淋巴細(xì)胞輸注治療小鼠H22肝癌的實(shí)驗(yàn)研究論文.freelide，CP）為江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司產(chǎn)品;5.氟脲嘧啶（5.FU）為天津金耀氨基酸有限公司產(chǎn)品。1.3實(shí)體型荷瘤鼠模型建立無(wú)菌操作取傳代8d的H22小鼠腹水，臺(tái)盼藍(lán)染色，活瘤細(xì)胞超過(guò)90%，調(diào)細(xì)胞濃度為1×107ml-1，分別取0.2ml接種于KM小鼠右側(cè)腋下皮下，接種后第3天可觸及腫瘤結(jié)節(jié)。1.4實(shí)驗(yàn)分組共分4組，每組10只（另備3只中途處死）。A組（荷瘤對(duì)照組）:不作任何處理;B組（5.FU化療組）:接種后第3天開(kāi)始化療，5.FU20mgkg-1腹腔注射，連續(xù)用藥7d

2、;C組［供者淋巴細(xì)胞輸注（donorlymphocytein-fusion，DLI）組］:接種前11d經(jīng)脾細(xì)胞加CP加供體脾細(xì)胞輸注的方法［1］誘導(dǎo)對(duì)BALB.C小鼠的特異性免疫耐受狀態(tài)，接種后第3、10、17天尾靜脈注射供鼠BALB.C脾臟淋巴細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)分別為0.5×107、0.5×107及1×107只-1。D組（5.FU加DLI組）:接種前4d誘導(dǎo)免疫耐受，接種后第3天開(kāi)始化療，方案同B組，第10、17、24天予DLI，細(xì)胞數(shù)同C組。1.5觀察指標(biāo)1.5.1生存時(shí)間記錄接種當(dāng)天開(kāi)始至小鼠死亡的時(shí)間，計(jì)算各治療組生命延長(zhǎng)率。1.5

3、.2抑瘤率待瘤結(jié)節(jié)長(zhǎng)出后每天用游標(biāo)卡尺測(cè)量瘤體長(zhǎng)短徑，比較瘤體生長(zhǎng)情況，計(jì)算接種后第15天各治療組抑瘤率。腫瘤體積=長(zhǎng)徑×短徑2.2;抑瘤率=（對(duì)照組腫瘤體積-治療組腫瘤體積）.對(duì)照組腫瘤體積×100%。1.5.3瘤體光鏡下組織病理學(xué)觀察接種后第15天各組處死3只小鼠取瘤體，固定包埋切片，HE染色光鏡觀察。常規(guī)無(wú)菌取脾，制備脾細(xì)胞懸液以備檢測(cè)。1.5.4NK細(xì)胞殺傷活性（NKCA）檢測(cè)參照文獻(xiàn)［2］的方法略有改動(dòng)。取上述已制備的脾細(xì)胞懸液4×106ml-1，加入96孔培養(yǎng)板，每孔100μl，每只小鼠脾細(xì)胞設(shè)3個(gè)重復(fù)孔。取傳代48h的H

4、22細(xì)胞，調(diào)細(xì)胞濃度為2×105ml-1，每孔加入100μl，使每孔效靶比為20∶1。平行設(shè)效應(yīng)細(xì)胞對(duì)照孔。按MTT方法加人試劑并測(cè)OD值，依下式計(jì)算殺傷率:NKCA（%）=［1-（實(shí)驗(yàn)孔OD值-效應(yīng)細(xì)胞對(duì)照孔OD值）.靶細(xì)胞對(duì)照孔OD值］×100%。1.5.5IL.2的誘生及其活性檢測(cè)參照文獻(xiàn)［3］T淋巴母細(xì)胞增殖分析法。（1）IL.2誘生:取上述已制備的脾細(xì)胞懸液5×106ml-1放入培養(yǎng)瓶，置37℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)40h，離心收集上清液，置-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。?）制備活化的脾淋巴細(xì)胞:無(wú)菌取正常KM小

5、鼠脾臟，制成5×106ml-1細(xì)胞懸液，加入ConA使其終濃度為5mgL-1，置37℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，收集細(xì)胞，離心洗滌2次，配成5×105ml-1細(xì)胞懸液作為檢測(cè)IL.2的反應(yīng)細(xì)胞。（3）IL.2活性檢測(cè):將待測(cè)小鼠脾細(xì)胞上清液用MTT比色法測(cè)定IL.2活性。1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有數(shù)據(jù)采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，結(jié)果以ˉx±s或百分率表示，兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)。2結(jié)果2.1小鼠生存情況各組小鼠100%死亡。A組生存時(shí)間（16.4±2.5）d;B、C組生存時(shí)間分別為（23.3±3.2）、（26.3±

6、3.1）d，較A組明顯延長(zhǎng)（P0.01）;D組小鼠平均生存期上升到（33.7±5.3）d，生命延長(zhǎng)率105.49%，與其他3組相比大大提高（P0.01）。2.2小鼠腫瘤生長(zhǎng)情況接種后第3天即可捫及瘤結(jié)節(jié)，A組隨即迅速增大，C組增大速度稍慢。B、D兩組用藥后3d內(nèi)腫瘤逐漸縮小，有些甚至完全消失;B組停藥后3d左右腫瘤又逐漸增大;D組腫瘤復(fù)發(fā)時(shí)間延長(zhǎng)至7d左右，再次DLI可控制瘤體生長(zhǎng)。接種后15d各組小鼠腫瘤生長(zhǎng)情況見(jiàn)表1。表1接種后15d各組小鼠腫瘤生長(zhǎng)情況（略）1）與A組比較，P0.01;2）與B組比較，P0.01;3）與C組比較，

7、P0.012.3對(duì)H22肝癌小鼠NK細(xì)胞活性的影響A、B、C、D各組NK細(xì)胞活性依次為16.9±2.8、35.9±3.1、78.4±5.5和47.3±3.7，正常小鼠為66.2±4.9。A組NK細(xì)胞活性較正常小鼠明顯下降（P0.05），B組與A組比較差異無(wú)顯著性（P0.05），C組NK細(xì)胞活性達(dá)正常水平（與A組比較，P0.05），D組與其余各組比較均有顯著差異（均為P0.05）。2.4IL.2的產(chǎn)生及其活性A、B、C、D各組IL.2活性依次為0.258±0.260、0.218±0.016、0.325±0.044和0.393±0.028

8、，正常小鼠為0.378±0.064。A組IL.2活性明顯低于正常小鼠（P0.05），B組與A組比較差異無(wú)顯著性（P0.05），C、D兩組IL.2活性達(dá)正常水平（與A組比較，均為P0.05）。2.5光鏡下瘤體組織病理學(xué)變化