供者淋巴細胞輸注治療小鼠h22肝癌的實驗研究

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1、供者淋巴細胞輸注治療小鼠H22肝癌的實驗研究作者：曾冬香，姜藻，畢延智，張琰［摘要］目的:觀察供者淋巴細胞輸注（DLI）對小鼠H22肝癌的治療作用。方法:荷瘤昆明小鼠分荷瘤對照組（A組）、5.氟脲嘧啶（5.FU）化療組（B組）、DLI組（C組）及5.FU加DLI組（D組）4組。比較各組小鼠生存期、抑瘤率及瘤體病理檢查結果，檢測NK細胞及IL.2的活性。結果:B、C組生存時間長于A組（P<0.01），D組長于C組（P<0.01）;B、C、D各組抑瘤率依次為61.3%、34.7%、89.5%;C、D兩組NK細胞及IL.2活性明顯高于A、B

2、組（P<0.05）;病理觀察見C、D組大量炎性細胞浸潤。結論:DLI對小鼠H22肝癌有治療作用，是一種潛在可行的實體瘤細胞過繼免疫治療方法?！　。坳P鍵詞］肝癌;供者淋巴細胞輸注;移植物抗腫瘤效應;免疫治療;小鼠　　隨著現代生物技術的發(fā)展，生物治療已逐漸成為治療腫瘤的重要手段之一。目前LAK細胞、TIL細胞、TAK細胞等過繼性細胞免疫療法都是給患者回輸其自身的淋巴細胞。本研究通過向荷瘤小鼠體內輸注正常的供者淋巴細胞，誘導特有的異體抗腫瘤反應來攻擊腫瘤，探索一種新的實體瘤過繼免疫治療方法。　　1材料與方法　　1.1動物　　BALB.C小鼠、KM

3、小鼠，雌性，均為8～10周齡，體重18～22g，由東南大學醫(yī)學院實驗動物中心提供。　　1.2試劑　　環(huán)磷酰胺（cyclophosphamide，CP）為江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司產品;5.氟脲嘧啶（5.FU）為天津金耀氨基酸有限公司產品?！　?.3實體型荷瘤鼠模型建立　　無菌操作取傳代8d的H22小鼠腹水，臺盼藍染色，活瘤細胞超過90%，調細胞濃度為1×107ml-1，分別取0.2ml接種于KM小鼠右側腋下皮下，接種后第3天可觸及腫瘤結節(jié)?！　?.4實驗分組　　共分4組，每組10只（另備3只中途處死）。A組（荷瘤對照組）:不作任何處理;B組（5.F

4、U化療組）:接種后第3天開始化療，5.FU20mg・kg-1腹腔注射，連續(xù)用藥7d;C組［供者淋巴細胞輸注（donorlymphocytein-fusion，DLI）組］:接種前11d經脾細胞加CP加供體脾細胞輸注的方法［1］誘導對BALB.C小鼠的特異性免疫耐受狀態(tài)，接種后第3、10、17天尾靜脈注射供鼠BALB.C脾臟淋巴細胞，細胞數分別為0.5×107、0.5×107及1×107只-1。D組（5.FU加DLI組）:接種前4d誘導免疫耐受，接種后第3天開始化療，方案同B組，第10、17、24天予DLI，細胞數同C組?！　?.5觀

5、察指標　　1.5.1生存時間記錄接種當天開始至小鼠死亡的時間，計算各治療組生命延長率?！　?.5.2抑瘤率待瘤結節(jié)長出后每天用游標卡尺測量瘤體長短徑，比較瘤體生長情況，計算接種后第15天各治療組抑瘤率。腫瘤體積=長徑×短徑2.2;抑瘤率=（對照組腫瘤體積-治療組腫瘤體積）.對照組腫瘤體積×100%?！　?.5.3瘤體光鏡下組織病理學觀察接種后第15天各組處死3只小鼠取瘤體，固定包埋切片，HE染色光鏡觀察。常規(guī)無菌取脾，制備脾細胞懸液以備檢測?！　?.5.4NK細胞殺傷活性（NKCA）檢測參照　　A、B、C、D各組NK細胞活性依次為16.9±2.8

6、、35.9±3.1、78.4±5.5和47.3±3.7，正常小鼠為66.2±4.9。A組NK細胞活性較正常小鼠明顯下降（P<0.05），B組與A組比較差異無顯著性（P>0.05），C組NK細胞活性達正常水平（與A組比較，P<0.05），D組與其余各組比較均有顯著差異（均為P<0.05）。　　2.4IL.2的產生及其活性　　A、B、C、D各組IL.2活性依次為0.258±0.260、0.218±0.016、0.325±0.044和0.393±0.028，正常小鼠為0.378±0.064。A組IL.2活性明顯低于正常小鼠（P&

7、lt;0.05），B組與A組比較差異無顯著性（P>0.05），C、D兩組IL.2活性達正常水平（與A組比較，均為P<0.05）?！　?.5光鏡下瘤體組織病理學變化　　光鏡下各組腫瘤組織均有不同程度的出血、壞死，其中B組纖維化明顯，C、D兩組瘤組織大片壞死，瘤細胞變小，核固縮、變性，間質內有大量炎性細胞浸潤（圖1），以淋巴細胞及巨噬細胞多見，D組還可見大量增生的淋巴濾泡（圖2）?！　D1C組瘤體光鏡下組織病理學改變×100　箭頭示間質內大量炎性細胞浸潤（略）　　圖2D組瘤體光鏡下組織病理學改變×100箭頭示增生的淋巴濾泡（略）　　3討論

8、　　早在20世紀70年代就有報道，用胸導管分出來的供者淋巴細胞不經任何預處理輸入來治療惡性腫瘤并取得暫時性的療效［4］。近年來，非清髓異