供者淋巴細胞輸注治療小鼠h22肝癌的實驗研究.doc

《供者淋巴細胞輸注治療小鼠h22肝癌的實驗研究.doc》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫。

1、供者淋巴細胞輸注治療小鼠H22肝癌的實驗研宄作者：曾冬香，姜藻，畢延智，張琰［摘要］目的：觀察供者淋巴細胞輸注對小鼠H22肝癌的治療作用。方法：荷瘤昆明小鼠分荷瘤對照組、5?氟脲嘧啶化療組、DLI組及加DLI組4組。比較各組小鼠生存期'抑瘤率及瘤體病理檢查結(jié)果，檢測皿細胞及的活性。結(jié)果:B、C組生存時間長于A組，D組長于C組;B、C、D各組抑瘤率依次為％、％、％;C、D兩組NK細胞及活性明顯高于A、B組；病理觀察見C、D組大量炎性細胞浸潤。結(jié)論:DLI對小鼠H22肝癌有治療作用，是一種潛在可行的實體瘤細胞

2、過繼免疫治療方法。［關(guān)鍵詞］肝癌；供者淋巴細胞輸注;移植物抗腫瘤效應;免疫治療;小鼠隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，生物治療已逐漸成為治療腫瘤的重要手段之一。目前LAK細胞、TIL細胞、TAK細胞等過繼性細胞免疫療法都是給患者回輸其自身的淋巴細胞。本研究通過向荷瘤小鼠體內(nèi)輸注正常的供者淋巴細胞，誘導特有的異體抗腫瘤反應來攻擊腫瘤，探索一種新的實體瘤過繼免疫治療方法。1材料與方法動物小鼠、KM小鼠，雌性，均為8?10周齡，體重18?22g，由東南大學醫(yī)學院實驗動物中心提供。試劑環(huán)磷酰胺為江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司產(chǎn)品

3、；5.氟脲嘧啶為天津金耀氨基酸有限公司產(chǎn)品。實體型荷瘤鼠模型建立無菌操作取傳代8d的H22小鼠腹水，臺盼藍染色，活瘤細胞超過90%，調(diào)細胞濃度為lX107ml_l，分別取接種于KM小鼠右側(cè)腋下皮下，接種后第3天可觸及腫瘤結(jié)節(jié)。實驗分組共分4組，每組10只。A組：不作任何處理;B組：接種后第3天開始化療，?kg-1腹腔注射，連續(xù)用藥7d;C組［供者淋巴細胞輸注組］:接種前l(fā)id經(jīng)脾細胞加CP加供體脾細胞輸注的方法［1］誘導對小鼠的特異性免疫耐受狀態(tài)，接種后第3、10、17天尾靜脈注射供鼠脾臟淋巴細胞，細胞數(shù)

4、分別為X107、X107及1X107只-1。D組：接種前4d誘導免疫耐受，接種后第3天開始化療，方案同B組，第10、17、24天予DLI，細胞數(shù)同C組。觀察指標生存時間記錄接種當天開始至小鼠死亡的時間，計算各治療組生命延長率。抑瘤率待瘤結(jié)節(jié)長出后每天用游標卡尺測量瘤體長短徑，比較瘤體生長情況，計算接種后第15天各治療組抑瘤率。腫瘤體積=長徑X短徑2.2;抑瘤率=.對照組腫瘤體積X100%。瘤體光鏡下組織病理學觀察接種后第15天各組處死3只小鼠取瘤體，固定包埋切片，HE染色光鏡觀察。常規(guī)無菌取脾，制備脾細胞

5、懸液以備檢測。NK細胞殺傷活性檢測參照文獻［2］的方法略有改動。取上述已制備的脾細胞懸液4X106m1-1，加入96孔培養(yǎng)板，每孔100P1，每只小鼠脾細胞設3個重復孔。取傳代48h的H22細胞，調(diào)細胞濃度為2X105m1-1，每孔加入lOOul，使每孔效靶比為20:1。平行設效應細胞對照孔。按MTT方法加人試劑并測0D值，依下式計算殺傷率：NKCA=[1-.靶細胞對照孔OD值]X100%o的誘生及其活性檢測參照文獻[3]T淋巴母細胞增殖分析法。誘生：取上述已制備的脾細胞懸液5X106ml_l放入培養(yǎng)瓶，

6、置37°C、體積分數(shù)為的C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)40h，離心收集上清液，置_20°C冰箱保存?zhèn)溆?。制備活化的脾淋巴細?無菌取正常KM小鼠脾臟，制成5X106ml-l細胞懸液，加入ConA使其終濃度為5mg?L-1，置37°C、體積分數(shù)為的C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，收集細胞，離心洗滌2次，配成5X105ml-l細胞懸液作為檢測的反應細胞?；钚詸z測：將待測小鼠脾細胞上清液用MTT比色法測定活性。統(tǒng)計學處理所有數(shù)據(jù)采用SPSS統(tǒng)計軟件進行分析，結(jié)果以_x±s或百分率表示，兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗。2結(jié)果小鼠生存情況

7、各組小鼠100%死亡。A組生存時間d;B、C組生存時間分別為、d，較A組明顯延長;D組小鼠平均生存期上升到d，生命延長率％，與其他3組相比大大提高。小鼠腫瘤生長情況接種后第3天即可捫及瘤結(jié)節(jié)，A組隨即迅速增大，C組增大速度稍慢。B、D兩組用藥后3d內(nèi)腫瘤逐漸縮小，有些甚至完全消失;B組停藥后3d左右腫瘤又逐漸增大;D組腫瘤復發(fā)時間延長至7d左右，再次DLI可控制瘤體生長。接種后15d各組小鼠腫瘤生長情況見表1。表1接種后15d各組小鼠腫瘤生長情況1）與A組比較，PA、B、C、D各組NK細胞活性依次為土、土

8、、土和土，正常小鼠為土。A組NK細胞活性較正常小鼠明顯下降，B組與A組比較差異無顯著性，C組NK細胞活性迗正常水平，D組與其余各組比較均有顯著差異。的產(chǎn)生及其活性A、B、C、D各組活性依次為土、土、士和士，正常小鼠為士。A組活性明顯低于正常小鼠，B組與A組比較差異無顯著性，C、D兩組活性達正常水平。光鏡下瘤體組織病理學變化光鏡下各組腫瘤組織均有不同程度的出血、壞死，其中B組纖維化明顯，C、D兩組瘤組織大片壞死，瘤細胞變小，核固