石蠟包埋切片制作法

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1、一、制備顯微標(biāo)本的切片法一石蠟包埋切片制作法這是最常用的切片法。以石蠟作為組織的填充支持介質(zhì)，將整塊組織加以包埋，最后凝固成均勻一致的固態(tài)結(jié)構(gòu)。用切片機(jī)制取極薄的切片。為了讓石蠟?zāi)芙虢M織內(nèi)部，需將組織經(jīng)過脫水等處理。過程大致如下：⑴固定：生物標(biāo)本脫離機(jī)體或培養(yǎng)環(huán)境，細(xì)胞會(huì)發(fā)生自溶，腐敗分解。因此，需用固定劑處理，使蛋白質(zhì)凝固停止瀕死或死后變化。凡供永久保存的標(biāo)本都需經(jīng)固定處理。常用的固定劑是甲醛、乙醇等，能使蛋白質(zhì)凝固。還有由幾種試劑配成的固定液，例如Carnoy固定液，由無水酒精、氯仿、冰醋酸配成，固定力更快更強(qiáng)，不含水分，可避免水溶性物質(zhì)如糖原等在固定過程中損失。

2、⑵脫水：是將組織細(xì)胞所含水分除去。通常用乙醇（Alcohol，酒精），濃度遞升到100%。此過程還使組織塊進(jìn)一步硬化。⑶透明：是用既能溶于純酒精又能融解石蠟的有機(jī)溶劑，將組織中的酒精取代，以便石蠟浸入。通常用二甲苯（xylene）為透明劑。⑷浸蠟：在溫箱內(nèi)進(jìn)行。已透明的組織塊放入加熱融解的石蠟中，讓石蠟浸透組織，作為支持介質(zhì)。⑸包埋：將已浸蠟的組織塊放入熱融的包埋石蠟中，迅速冷凝，組織決便被蠟包埋。⑹切片：用切片機(jī)。常用的切片機(jī)有輪轉(zhuǎn)式、平推式的。用輪轉(zhuǎn)式的易于切出連續(xù)切片。切片厚度隨制片目的而調(diào)整。教學(xué)標(biāo)本厚度多是5~6μm。⑺貼片烤干：石蠟切片在溫水上展平后，移在玻

3、片上，烤干，即可供染色處理。染色后用樹膠、蓋坡片封固，可永久保存。二冷凍切片法冷凍切片法是借組織在低溫下，凍結(jié)變硬而達(dá)到符合切片要求。冷凍切片法需有冷凍切片機(jī)，或在普通切片上配制冷設(shè)施。恒冷切片機(jī)是高級(jí)冷凍切片設(shè)備。它有一個(gè)恒冷箱，標(biāo)本致冷臺(tái)和切片機(jī)都裝在箱內(nèi)。恒冷箱的作用類似冰箱，可在一定范圍內(nèi)調(diào)整溫度，其結(jié)構(gòu)有利于保持箱內(nèi)恒定低溫，減少箱門打開時(shí)環(huán)境溫度的干擾。切片機(jī)的輪轉(zhuǎn)把手裝在箱外，便于操縱切片。冷凍切片法的優(yōu)點(diǎn)是：在處理得當(dāng)時(shí)，它可以最大限度地保持組織的新鮮狀態(tài)。并且，由于不需經(jīng)脫水、透明、浸蠟等過程中有機(jī)溶劑的處理，及濕箱浸蠟熱的影響，甚至可不經(jīng)固定。所以能

4、很好地保存組織細(xì)胞的各種成分和酶的活性，因此在酶的組織化學(xué)研究中常用此切片法。二、顯示標(biāo)本結(jié)構(gòu)成分的染色法一蘇木素伊紅染色法（HE染色法）為最常用的染色法。該法應(yīng)用于各種組織的染色，是組織學(xué)技術(shù)的基本方法，對(duì)任何液體固定的組織和各種包埋的切片均可使用，只是對(duì)不同包埋的切片法處理略有不同。下面簡介石蠟包埋切片的HE染色法。1、脫蠟：石蠟切片的組織內(nèi)部充滿石蠟，不能使水溶性染液著色，因此在染色前必須首先用二甲苯將石蠟脫掉，共兩次。2、下行入水：將已脫蠟的標(biāo)本浸入無水酒精及各級(jí)酒精，使組織逐步接近水。3、蒸餾水略洗。4、蘇木素溶液染色約5—15分鐘5、自來水洗去多余染料。6、

5、入稀釋的鹽酸酒精溶液中分色，邊分色邊鏡檢，至核呈紅紫色，細(xì)胞質(zhì)無色為合適。7、分色后用自來水或加數(shù)滴氨水堿化，直至細(xì)胞核變成藍(lán)色。這一步驟也可稱為“藍(lán)化”。8、入蒸餾水洗去堿性水分。9、入70%酒精→80%酒精各5分鐘。10、入伊紅染液染色30秒至數(shù)分鐘。11、以95%酒精對(duì)伊紅分色，至胞漿，結(jié)締組織等呈桃紅色。12、上行脫水：染色后的切片，因組織內(nèi)含水而不透明，不能清晰地觀察其微細(xì)結(jié)構(gòu)。因此，須將組織內(nèi)的水分經(jīng)各級(jí)酒精→無水酒精逐步置換，最后進(jìn)入不含水份的透明劑內(nèi)。13、透明：入二甲苯透明劑，二次（各數(shù)分鐘）。14、取出切片：將組織周圍多余的二甲苯擦去，滴樹膠后加蓋玻

6、片封固。結(jié)果：細(xì)胞核藍(lán)紫色，胞漿、膠原纖維、肌纖維為桃紅色，嗜酸性顆粒為鮮紅色，彈性纖維呈明亮桃紅色。二組織化學(xué)和細(xì)胞化學(xué)染色法組織化學(xué)和細(xì)胞化學(xué)，是將物理和化學(xué)的技術(shù)運(yùn)用到組織標(biāo)本，用顯微鏡和化學(xué)分析方法來研究組織和細(xì)胞內(nèi)的化學(xué)成分，并觀察該化學(xué)成分在組織、細(xì)胞內(nèi)的定位、含量及其變化規(guī)律。這些化學(xué)成分借著化學(xué)反應(yīng)所產(chǎn)生的不溶性著色物質(zhì)來顯示。對(duì)于某些化學(xué)成分，例如：Fe++糖原、核酸等，可以用直接或間接的化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生著色沉淀而顯示其部位和相對(duì)含量。對(duì)于酶類，顯示它的活性，須有該種酶的底物（被該種酶作用的物質(zhì)），由酶對(duì)底物的分解，直接或間接地生成著色物質(zhì)而被顯示。凡是在

7、光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞原位顯示的化學(xué)物質(zhì)，稱組織化學(xué)，若用電鏡觀察細(xì)胞原位化學(xué)成分的著色部位，則稱電鏡細(xì)胞化學(xué)，下面從原理方面簡要介紹幾種常用的組織化學(xué)染色技術(shù)：1、顯示琥珀酸脫氫酶（SDH）活性的硝基-BT法：（Succinatedehydrogenase）⑴酶的定位及生物學(xué)意義：琥珀酸脫氫酶是線粒體標(biāo)志酶，其存在于所有有氧呼吸的細(xì)胞，和線粒體內(nèi)膜緊密結(jié)合。該酶不需輔酶而自身有黃素蛋白（FP,Flavoprotein）為輔基。在組化反應(yīng)中常用來反映三羧酸循環(huán)的情況。其催化過程如下：弱-單甲（紫紅色）HOOC-CH2-CH2-COOHFPH