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1、苯酚-硫酸法測定蛹蟲草中多糖含量【關鍵詞】蛹蟲草多糖；苯酚-硫酸法；含量?蛹蟲草（Cordycepsmilitaris）,別名北冬蟲夏草、北蟲草。野生蛹蟲草具有多種藥用價值、滋補功能，可與人參、鹿茸相媲美。其所含的蟲草素、甘露醇、SOD等成分，均達到或超過名貴中藥冬蟲夏草。具有抗疲勞、抗衰老、增強免疫和性功能等作用，可殺滅喉癌細胞，能補肺益腎壯陽，有扶虛損、益精氣、止血、化痰、鎮(zhèn)靜、免疫等多種功能。其有效活性成分蟲草多糖(CMPS)被認為是非特異性免疫調(diào)節(jié)劑,可激活肌體的免疫活性細胞。本文通過苯酚-硫酸法,測定蛹蟲草中多含量，此方法簡便、結(jié)果準
2、確、重現(xiàn)性好、顏色穩(wěn)定。因此，可采用苯酚-硫酸法測定蛹蟲草中多糖含量。?1材料與方法?1．1材料蛹蟲草由撫順師專生化系蛹蟲草課題組提供。?1．2儀器與試劑濃硫酸（GR）95%乙醇和無水葡萄糖均為市售分析純。苯酚試劑：取苯酚(CP>200g、加鋁片0．2g和碳酸氫鈉0．1g，蒸餾，收集1806℃左右餾分。將新蒸苯酚配成6%溶液，放入棕色瓶，置于冰箱中保存?zhèn)溆?。其它均為分析純。UNIC7200型分光光度計(上海尤尼科儀器有限公司)?1．3方法?1．3．1蛹蟲草多糖的提取與精制新鮮的蛹蟲草，烘干，粉碎后，用無水乙醇提取數(shù)次，殘渣風干。取適量干粉，放于
3、磨口三角瓶中，按料水比1∶20，在溫度100℃的熱水浴中回流浸提2h，冷卻后離心，合并上清液。上清液用酶法去除淀粉，按20U/g加液化酶到上清液中，在pH為6，溫度為65℃的水浴條件下處理，用I2/KI溶液檢驗，直到碘液不變色為止。接著用Sevag法除去蛋白質(zhì)，在水浴揮去有機相，H?2O?2除色，然后加3倍體積95%乙醇溶液，冷凍離心機離心，冷凍干燥即得精制CMPS。?1．3．2葡萄糖標準曲線的測定?精確稱取105℃干燥恒重的葡萄糖100mg，置于100ml容量瓶中定容，搖勻。取10ml溶液于100ml容量瓶中定容，搖勻(含葡萄糖100μg/m
4、l)，備用。分別吸取葡萄糖標準溶液0．1、0．2、0．3、0．4、0．5、0．6、0．7、0．8ml,用蒸餾水補充至2．0ml加入5%的苯酚溶液1ml，搖勻，加入濃硫酸5ml室溫下放置10min，于490nm處測定吸光度值(以2．0ml蒸餾水作為空白)，得到回歸方程為：A=0．0091Cr=0．99766其中：A為吸光值，C為葡萄糖濃度?1．3．3樣品液的制備?稱取用無水乙醇處理過的蛹蟲草干粉10g，按照最優(yōu)提取方案進行提取，除淀粉，除蛋白，用95%的乙醇沉淀，4000r/min離心，沉淀用蒸餾水溶解，用500ml的容量瓶定容，即得樣品液。?1
5、．3．4換算因子的測定精密稱取干燥至恒重的精制CMPS粉末5mg，置于50ml容量瓶中，加水溶解至刻度，搖勻備用。精密量取該貯備液1．0ml，按照“1．3．2”的方法測定吸光度，計算出多糖中葡萄糖的濃度，按下式計算出換算因子，F(xiàn)=W/(C.D)，W為多糖重量(mg)，C為多糖中葡萄糖的濃度(mg/ml)，D為多糖的稀釋因素，測得F=2．031(n=3)。?1．3．5穩(wěn)定性試驗取樣品供試液，按葡萄糖標準曲線測定方法，將同一份反應液間隔一定時間，測定吸光值。?1．3．6精密度試驗取樣品供試品溶液，按葡萄糖標準曲線所述的含量測定方法，重復測定5次，記
6、錄吸光值。?1．3．7回收率試驗采用加樣回收法。吸取多糖樣品溶液0．5ml，分別加入標準葡萄糖溶液0．1、0．2、0．3、0．4、0．56ml，按照上述方法分別測其吸光度，根據(jù)葡萄糖的檢出量，計算其回收率。結(jié)果見表1?；厥章?(實驗測值-樣品所含被測成分量)/加入純品量*100％?1．3．8多糖含量的測定吸取樣品液1．0ml，用重蒸水定容至100ml，取定容液1．0ml，按上述步驟操作，同時做5個重復，測吸光度，以標準曲線和下式計算樣品中多糖的百分含量。多糖含量(%)=C.D.F/wC為供試液葡萄糖濃度，D為供試液的稀釋因素，F(xiàn)為換算因素，W為
7、供試品的重量。?2結(jié)果與分析?2．1穩(wěn)定性試驗結(jié)果間隔10、20、30、40、60min測定的吸光度分別為0．448、0．449、0．448、0．450、0．449。穩(wěn)定試驗RSD為0．167%，表明樣品在60min內(nèi)穩(wěn)定性良好。?2．2精密度試驗結(jié)果測定1、2、3、4、5次吸光度值分別為0．445、0．443、0．447、0．444、0．445精密度試驗RSD為0．298%，表明儀器精密度良好。?2．3回收率測定結(jié)果表１表明：本試驗的RSD為0．36%，表明本方法的準確率較高。2．4多糖含量測定結(jié)果表２表明：測得蛹蟲草多糖含量為13．3%,R
8、SD為0．21%，表明結(jié)果準確。?
63小結(jié)與討論?3．1本試驗采用苯酚-硫酸法，此方法簡便、結(jié)果準確、重現(xiàn)性好、顏色穩(wěn)定。因此，可采用苯酚-硫酸法測
