在活體成像中熒光色素標記細胞的方法舉例

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1、www.scimall.cn上海睿之生物醫(yī)藥科技有限公司本實驗技術(shù)來源于SciMall科學在線在活體成像中熒光色素標記細胞的方法舉例活體光學成像(OpticalinvivoImaging)主要采用生物發(fā)光（bioluminescence）技術(shù)與熒光（fluorescence）技術(shù)。生物發(fā)光是用熒光素酶(Luciferase)基因標記細胞或DNA，今天，生物發(fā)光標記物可以標記到任何一種基因上，使對基因功能的全面細致研究成為現(xiàn)實。而熒光技術(shù)則采用熒光報告基團（GFP、RFP,Cyt及dyes等）進行標記，利用熒光蛋白在外源光源或是內(nèi)源發(fā)光照射下被激發(fā)產(chǎn)生的熒光作為

2、檢測信號。研究人員能夠利用一套非常靈敏的光學檢測儀器直接監(jiān)控活體生物體內(nèi)的細胞活動和基因行為。????該技術(shù)可被廣泛應用于標記細胞或基因的示蹤及檢測；基因治療在活體動物體內(nèi)直接的觀察和檢測；基因組、蛋白組學、藥學及生物技術(shù)在活體動物內(nèi)的研究；藥物及化學合成藥物的藥物代謝及毒理學監(jiān)測；食品菌落生長成像；皮膚醫(yī)學中皮膚疾病的體內(nèi)成像；法醫(yī)鑒定；微孔板成像，例如：免疫分析、報告基因、基因探針和嗜菌作用分析等；熒光團的體內(nèi)成像，例如：Alzheimer疾病研究中結(jié)合嗪的β-淀粉沉淀物分析；轉(zhuǎn)基因植物中通過報告基因?qū)ι碇芷诠?jié)奏的研究；凝膠成像分析等等。????但在研究

3、過程中，研究者們必須事先用基因技術(shù)進行熒光素酶基因標記，或者某種熒光報告基團標記。目前活體光學成像系統(tǒng)的知名制造商，如Berthold、GE、Xenogen、Photometrics、CarestreamHealth等，不僅為客戶提供先進的儀器，也提供具體實驗所需的整套解決方案，包括試劑、實驗手冊、特殊用途的質(zhì)粒、細胞株、轉(zhuǎn)基因動物、細胞處理和動物處理設(shè)施等配套技術(shù)支持。出色的多任務(wù)處理能力，人性化的整體設(shè)計，便捷精確的操作系統(tǒng)，使實驗室影像分析領(lǐng)域進入了一個全新的時代????下面以研究干細胞活體移植后的存活率為例，簡介一兩種內(nèi)源性熒光色素標記的實驗方法，以供

4、參考。一、用熒光色素DiD標記間充質(zhì)干細胞1.先用胰蛋白酶消化待標記材料，使之成為一定密度的懸浮液；2.從細胞培養(yǎng)箱中取出間充質(zhì)干細胞，吸取含原有培養(yǎng)基的細胞懸浮液進行標記；3.用10mlMg/Ca-freePBS（不含鈣鎂離子的磷酸緩沖液）清洗細胞，吸去PBS，非常感謝您使用“Scimall科學在線”提供的產(chǎn)品和服務(wù)，更多信息請訪問www.scimall.cnwww.scimall.cn上海睿之生物醫(yī)藥科技有限公司鈣鎂離子會影響胰蛋白酶的活性，必須小心；4.加入預熱的0.05%胰蛋白酶液，加液量以T75型瓶為例，每瓶加5ml，確保瓶的表面被完全覆蓋；5.在細

5、胞培養(yǎng)箱中37°C孵育約5分鐘；6.然后在顯微鏡下確認細胞已經(jīng)完全分散，如果有細胞貼壁情況，輕拍若干次或延長孵育時間直至酶解消化完全成功；7.加入等量含10%FCS的培養(yǎng)基中和胰蛋白酶；8.用移液器反復吸取幾次確保細胞均勻分散；9.然后移取細胞懸浮液至15ml已滅菌的有蓋聚丙烯離心管中；10.400RCF離心5分鐘；11.小心移去上清液，不要擾動細胞；12.將細胞重新懸浮于DMEM并進行計數(shù)；13.需要待標記細胞在無血清DMEM溶液中的密度應為1x106/ml；14.每ml細胞懸浮液加入5μLDiD染色液；15.用移液器將染色液與細胞懸浮液混合均勻；16.在6

6、孔低附著性細胞板上37°C孵育20分鐘；17.孵育完全后移取細胞懸浮液至15ml已滅菌的有蓋聚丙烯離心管中；18.400RCF離心5分鐘；19.小心移去染色液，不要擾動細胞；20.用PBS清洗細胞，用移液器反復吸取幾次確保細胞均勻分散；21.重復洗三次；22.細胞重新計數(shù)并用臺盼藍染色法檢測細胞活性；23.可以進行活細胞成像了！二、用熒光色素ICG標記人胚胎干細胞1.必須先準備好吲哚菁綠溶液（血容量、心輸出量、肝功能測定劑）作為對照品非常感謝您使用“Scimall科學在線”提供的產(chǎn)品和服務(wù)，更多信息請訪問www.scimall.cnwww.scimall.cn

7、上海睿之生物醫(yī)藥科技有限公司，然后使之與轉(zhuǎn)染試劑魚精蛋白（抗凝血作用）混合；2.測出1ml吲哚菁綠溶液的活力，然后在100μLDMSO中溶解ICG；3.向混合物中加入400μLDulbecco的改良Eagles培養(yǎng)基(DMEM+10%胎牛血清)，震蕩均勻，吲哚菁綠溶液終濃度為2mg/ml；4.加入轉(zhuǎn)染試劑魚精蛋白，魚精蛋白作為對照品的載體，使之能夠有效進入細胞；5.在300μLICG和300μL無血清Dulbecco改良Eagles培養(yǎng)基中混入5μL硫酸魚精蛋白溶液,使之終濃度為10mg/ml,；6.震蕩5分鐘使之形成復合物，標記溶液制備完畢；7.從hESC1

8、0mmPetri培養(yǎng)皿中移去原有培養(yǎng)基