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《在活體成像中熒光色素標(biāo)記細(xì)胞的方法舉例》由會員上傳分享,免費在線閱讀,更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、www.scimall.cn上海睿之生物醫(yī)藥科技有限公司本實驗技術(shù)來源于SciMall科學(xué)在線在活體成像中熒光色素標(biāo)記細(xì)胞的方法舉例活體光學(xué)成像(OpticalinvivoImaging)主要采用生物發(fā)光(bioluminescence)技術(shù)與熒光(fluorescence)技術(shù)。生物發(fā)光是用熒光素酶(Luciferase)基因標(biāo)記細(xì)胞或DNA,今天,生物發(fā)光標(biāo)記物可以標(biāo)記到任何一種基因上,使對基因功能的全面細(xì)致研究成為現(xiàn)實。而熒光技術(shù)則采用熒光報告基團(tuán)(GFP、RFP,Cyt及dyes等)進(jìn)行標(biāo)記,利用熒光
2、蛋白在外源光源或是內(nèi)源發(fā)光照射下被激發(fā)產(chǎn)生的熒光作為檢測信號。研究人員能夠利用一套非常靈敏的光學(xué)檢測儀器直接監(jiān)控活體生物體內(nèi)的細(xì)胞活動和基因行為。????該技術(shù)可被廣泛應(yīng)用于標(biāo)記細(xì)胞或基因的示蹤及檢測;基因治療在活體動物體內(nèi)直接的觀察和檢測;基因組、蛋白組學(xué)、藥學(xué)及生物技術(shù)在活體動物內(nèi)的研究;藥物及化學(xué)合成藥物的藥物代謝及毒理學(xué)監(jiān)測;食品菌落生長成像;皮膚醫(yī)學(xué)中皮膚疾病的體內(nèi)成像;法醫(yī)鑒定;微孔板成像,例如:免疫分析、報告基因、基因探針和嗜菌作用分析等;熒光團(tuán)的體內(nèi)成像,例如:Alzheimer疾病研究中結(jié)合
3、嗪的β-淀粉沉淀物分析;轉(zhuǎn)基因植物中通過報告基因?qū)ι碇芷诠?jié)奏的研究;凝膠成像分析等等。????但在研究過程中,研究者們必須事先用基因技術(shù)進(jìn)行熒光素酶基因標(biāo)記,或者某種熒光報告基團(tuán)標(biāo)記。目前活體光學(xué)成像系統(tǒng)的知名制造商,如Berthold、GE、Xenogen、Photometrics、CarestreamHealth等,不僅為客戶提供先進(jìn)的儀器,也提供具體實驗所需的整套解決方案,包括試劑、實驗手冊、特殊用途的質(zhì)粒、細(xì)胞株、轉(zhuǎn)基因動物、細(xì)胞處理和動物處理設(shè)施等配套技術(shù)支持。出色的多任務(wù)處理能力,人性化的整體設(shè)
4、計,便捷精確的操作系統(tǒng),使實驗室影像分析領(lǐng)域進(jìn)入了一個全新的時代????下面以研究干細(xì)胞活體移植后的存活率為例,簡介一兩種內(nèi)源性熒光色素標(biāo)記的實驗方法,以供參考。一、用熒光色素DiD標(biāo)記間充質(zhì)干細(xì)胞1.先用胰蛋白酶消化待標(biāo)記材料,使之成為一定密度的懸浮液;2.從細(xì)胞培養(yǎng)箱中取出間充質(zhì)干細(xì)胞,吸取含原有培養(yǎng)基的細(xì)胞懸浮液進(jìn)行標(biāo)記;3.用10mlMg/Ca-freePBS(不含鈣鎂離子的磷酸緩沖液)清洗細(xì)胞,吸去PBS,非常感謝您使用“Scimall科學(xué)在線”提供的產(chǎn)品和服務(wù),更多信息請訪問www.scimall
5、.cnwww.scimall.cn上海睿之生物醫(yī)藥科技有限公司鈣鎂離子會影響胰蛋白酶的活性,必須小心;4.加入預(yù)熱的0.05%胰蛋白酶液,加液量以T75型瓶為例,每瓶加5ml,確保瓶的表面被完全覆蓋;5.在細(xì)胞培養(yǎng)箱中37°C孵育約5分鐘;6.然后在顯微鏡下確認(rèn)細(xì)胞已經(jīng)完全分散,如果有細(xì)胞貼壁情況,輕拍若干次或延長孵育時間直至酶解消化完全成功;7.加入等量含10%FCS的培養(yǎng)基中和胰蛋白酶;8.用移液器反復(fù)吸取幾次確保細(xì)胞均勻分散;9.然后移取細(xì)胞懸浮液至15ml已滅菌的有蓋聚丙烯離心管中;10.400RCF
6、離心5分鐘;11.小心移去上清液,不要擾動細(xì)胞;12.將細(xì)胞重新懸浮于DMEM并進(jìn)行計數(shù);13.需要待標(biāo)記細(xì)胞在無血清DMEM溶液中的密度應(yīng)為1x106/ml;14.每ml細(xì)胞懸浮液加入5μLDiD染色液;15.用移液器將染色液與細(xì)胞懸浮液混合均勻;16.在6孔低附著性細(xì)胞板上37°C孵育20分鐘;17.孵育完全后移取細(xì)胞懸浮液至15ml已滅菌的有蓋聚丙烯離心管中;18.400RCF離心5分鐘;19.小心移去染色液,不要擾動細(xì)胞;20.用PBS清洗細(xì)胞,用移液器反復(fù)吸取幾次確保細(xì)胞均勻分散;21.重復(fù)洗三次;
7、22.細(xì)胞重新計數(shù)并用臺盼藍(lán)染色法檢測細(xì)胞活性;23.可以進(jìn)行活細(xì)胞成像了!二、用熒光色素ICG標(biāo)記人胚胎干細(xì)胞1.必須先準(zhǔn)備好吲哚菁綠溶液(血容量、心輸出量、肝功能測定劑)作為對照品非常感謝您使用“Scimall科學(xué)在線”提供的產(chǎn)品和服務(wù),更多信息請訪問www.scimall.cnwww.scimall.cn上海睿之生物醫(yī)藥科技有限公司,然后使之與轉(zhuǎn)染試劑魚精蛋白(抗凝血作用)混合;2.測出1ml吲哚菁綠溶液的活力,然后在100μLDMSO中溶解ICG;3.向混合物中加入400μLDulbecco的改良Ea
8、gles培養(yǎng)基(DMEM+10%胎牛血清),震蕩均勻,吲哚菁綠溶液終濃度為2mg/ml;4.加入轉(zhuǎn)染試劑魚精蛋白,魚精蛋白作為對照品的載體,使之能夠有效進(jìn)入細(xì)胞;5.在300μLICG和300μL無血清Dulbecco改良Eagles培養(yǎng)基中混入5μL硫酸魚精蛋白溶液,使之終濃度為10mg/ml,;6.震蕩5分鐘使之形成復(fù)合物,標(biāo)記溶液制備完畢;7.從hESC10mmPetri培養(yǎng)皿中移去原有培養(yǎng)基