實驗2：分離以尿素為氮源的微生物

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1、實驗2分離以尿素為氮源的微生物思考：采用什么方法從土壤中分離出以尿素為氮源的微生物？如何判斷分離出的細(xì)菌確實能將尿素分解？一.實驗原理尿素NH3中性堿性酚紅顏色：(酸性)黃色紅色(變色范圍pH6.4-8.2)二.實驗?zāi)康氖褂靡阅蛩貫槲ㄒ坏吹呐囵B(yǎng)基分離細(xì)菌(有脲酶)通過指示劑（酚紅）顏色的變化檢知培養(yǎng)基pH的變化(脲酶催化的化學(xué)反應(yīng))以尿素為氮源的微生物培養(yǎng)一段時間后，由于細(xì)菌產(chǎn)生的脲酶向周圍擴(kuò)散，將培養(yǎng)基中尿素的分解，產(chǎn)生的NH3使培養(yǎng)基的pH由原來的中性變?yōu)閴A性，于是培養(yǎng)基中的酚紅變成紅色，菌落的周圍會產(chǎn)生紅色環(huán)帶，紅色環(huán)帶

2、愈大，表明這種菌利用尿素的能力愈強。三.實驗步驟２.倒平板３.制備一定濃度梯度的細(xì)菌懸液１g土壤＋９９ml無菌水，振蕩，為１０-2稀釋液，依次制備１０-3、１０-4、１０-5的土壤稀釋液。４.稀釋涂布分離法分離細(xì)菌１.制備無菌的全營養(yǎng)ＬＢ固體培養(yǎng)基和尿素固體培養(yǎng)基５.培養(yǎng)觀察（倒置，37℃24-48h）（無菌，0.1ml，玻璃刮刀）1、配制培養(yǎng)基尿素培養(yǎng)基葡萄糖0.025gNaCl0.12gK2HPO40.12g瓊脂糖0.5g酚紅0.25g尿素10mlLB培養(yǎng)基蛋白胨：0.25g酵母提取液：0.12gNaCl：0.25g瓊脂糖：

3、0.5g對照組選擇培養(yǎng)基實驗組為什么用瓊脂糖代替瓊脂？怎么獲得無菌的尿素溶液？瓊脂和瓊脂糖瓊脂是一種未被純化的混合物，主要成分為瓊脂糖和瓊脂果膠，還含有少量的含氮化合物，及其它有機(jī)雜質(zhì)和不溶性雜質(zhì)。瓊脂作為微生物固體培養(yǎng)基不可缺少的組成成分，其優(yōu)點是：①其主要成分不能被微生物利用；②可使培養(yǎng)基固化；③不影響培養(yǎng)基中其他營養(yǎng)物質(zhì)被細(xì)菌吸收。實驗是用瓊脂糖代替瓊脂作為微生物培養(yǎng)基的固化劑，其目的是：盡可能使培養(yǎng)基中只含尿素一種含氮化合物，以防止瓊脂中的含氮化合物被以非尿素為氮源的細(xì)菌利用，有利于對這類細(xì)菌的篩選。思考？選擇培養(yǎng)基加入

4、青霉素的培養(yǎng)基:分離酵母菌、霉菌等真菌加入高濃度食鹽的培養(yǎng)基:分離金黃色葡萄球菌不加氮源的無氮培養(yǎng)基:分離固氮菌不加含碳有機(jī)物的無碳培養(yǎng)基:分離自養(yǎng)型微生物加入青霉素等抗生素的培養(yǎng)基:分離導(dǎo)入了目的基因的受體細(xì)胞——添加或缺少某種化學(xué)成分用于菌種的分離2、倒平板制備空白平板：取2個三角瓶，分別裝入已滅菌的全營養(yǎng)LB固體培養(yǎng)基和尿素固體培養(yǎng)基，放在超凈工作臺上，冷卻至60℃左右時，在酒精燈旁把上述兩種培養(yǎng)基分別倒至培養(yǎng)皿中，輕輕搖勻，平放至凝固。2、倒平板在無菌條件下，在將1g土樣加到裝有99mL無菌水的三角瓶中，振蕩10min，

5、即成10-2土壤稀釋液，并依次制備出10-3～10-5稀釋液。例如，若想制備10-3的稀釋液，可取0.5mL10-2的稀釋液。取樣時，盡量只取懸液，倒入有4.5mL無菌水的有蓋試管中，搖勻，放在試管架上。3、制備細(xì)菌懸液4、涂布分離涂布法分離細(xì)菌：在無菌條件下，分別取0.1mL的稀釋度為10-3、10-4和10-5的土壤稀釋液（細(xì)菌懸液），分別加到裝有全營養(yǎng)LB培養(yǎng)基和尿素培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿（空白平板）中；再將保存在70%酒精中的玻璃刮刀放在酒精燈火焰上，待刮刀上火焰熄滅后，在酒精燈火焰旁打開培養(yǎng)皿，將前面已加入的土壤稀釋液（細(xì)菌懸

6、液）均勻涂布到整個平面上。接種取0.1ml菌懸液涂布分離按濃度捆成一摞5、37℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)四1、為什么要用瓊脂糖代替瓊脂配置固體培養(yǎng)基因為瓊脂是未被純化的混合物，內(nèi)含一定量的含氮化合物。如果用瓊脂固化培養(yǎng)基，會為細(xì)菌提供一定量的非尿素類氮源，這樣會在尿素固體培養(yǎng)上產(chǎn)生大量以非尿素為氮源的細(xì)菌，不利于以尿素為氮源的細(xì)菌的篩選，故用純化的瓊脂糖而不用瓊脂做固化劑思考題：2、有脲酶的細(xì)菌在生態(tài)穩(wěn)態(tài)上起什么作用如果土壤中有許多尿素，在自然界較高溫度下就會被水解，水解后的NH3會使土壤變成堿性，NH3與其他陰離子物質(zhì)如SO42－、

7、CO32－、NO3－等形成化合物，則會使土壤板結(jié)。有脲酶的細(xì)菌使植物廢棄物和動物尸體降解，并利用了所形成的氨，有利于自然界中氮的循環(huán)。3、有脲酶的細(xì)菌菌落周圍為什么有著色的環(huán)帶出現(xiàn)。細(xì)菌向胞外分泌脲酶，使培養(yǎng)基中尿素水解，水解后產(chǎn)生氨，氨為堿性，酚紅在酸性環(huán)境里呈黃色，堿性里呈紅色。培養(yǎng)基中酸堿指示劑產(chǎn)生顏色變化（變紅），標(biāo)志著存在脲酶水解尿素的作用，從而證明這一菌株以尿素為氮源。4、與全營養(yǎng)培養(yǎng)基上的菌落數(shù)比較，為什么尿素培養(yǎng)基上只有少數(shù)菌落因為全營養(yǎng)培養(yǎng)基中的氮源是蛋白胨，很多細(xì)菌都能利用它，而尿素培養(yǎng)基中的氮源只有尿素，只

8、有含脲酶的細(xì)菌才能利用尿素，能存活。這一現(xiàn)象表明能利用尿素的細(xì)菌在土壤菌群中只占有極少數(shù)量。