實驗2：分離以尿素為氮源的微生物.ppt

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1、實驗2：分離以尿素為氮源的微生物尿素是蛋白質(zhì)降解的產(chǎn)物，通常用作植物的氮肥。但是植物的根幾乎不吸收尿素，尿素經(jīng)微生物(脲酶)分解為氨,氨溶解于水中成為銨根離子而被植物吸收。一、基礎(chǔ)知識1、尿素(脲)：大量尿素的存在會對環(huán)境造成污染，如土壤板結(jié)、肥料利用率下降、地下水污染等。例如：2、選擇培養(yǎng)基：添加或減少某種成分，以允許某種微生物生長，同時抑制或阻止其他種類微生物生長的培養(yǎng)基。培養(yǎng)基中缺乏有機碳源時可篩選出自養(yǎng)型微生物只以尿素為氮源的培養(yǎng)基可篩選出含脲酶的微生物一、基礎(chǔ)知識3、玻璃砂漏斗：玻璃砂(砂

2、芯)漏斗有6種：G1~G6(砂芯含有不同規(guī)格小孔)。G6孔徑最小，細(xì)菌不能濾過。若培養(yǎng)基中含有不能加熱滅菌的化合物，如尿素(加熱會分解)等，只能用G6玻璃砂漏斗過濾來除去微生物。玻璃砂漏斗用前也要進行高壓蒸汽滅菌(121℃，15min)。用后需用1mol/L的HCl浸泡，并抽濾去酸，再用蒸餾水洗至洗出液呈中性，干燥后保存。體積調(diào)節(jié)按紐吸頭脫卸按紐容量顯示窗吸頭(槍頭)套筒彈性吸嘴一、基礎(chǔ)知識4、移液器：移液器是一種在一定容量范圍內(nèi)可隨意調(diào)節(jié)的精密取液裝置（俗稱移液槍）。（1）結(jié)構(gòu)：（2）使用方法：各

3、種規(guī)格吸頭各種規(guī)格移液器移液器的使用根據(jù)取用溶液體積選用適當(dāng)?shù)囊埔浩鞑僮鞣椒ǎ涸O(shè)定體積安裝吸頭吸液放液卸掉吸頭從大值調(diào)整到小值時，逆時針旋轉(zhuǎn)體積調(diào)節(jié)按紐到剛好即可。從小值調(diào)整到大值時，應(yīng)順時針先調(diào)至超過設(shè)定值后再回調(diào)。設(shè)定體積安裝吸頭將移液器頂端垂直插入吸頭，再輕輕用力下壓的同時，左右微微轉(zhuǎn)動，上緊即可。切記用力不能過猛，選擇與移液器匹配的吸頭。吸液1、預(yù)洗吸頭：吸取、排放樣液2~3次，讓吸頭內(nèi)壁形成一道同質(zhì)液膜，確保移液工作的精度和準(zhǔn)度。一般液體，正向吸液(將按鈕按到第一檔釋放吸液)粘稠液體和易揮

4、發(fā)液體，反相吸液(將按鈕直接按到第二檔吸液)2、垂直吸液、慢吸慢放：吸頭垂直浸入液面2-4mm。盡量避免吸頭浸入液面過深，以免液壓對吸液的精確度造成影響。吸液速度切記不能過快，以免導(dǎo)致液體吸入移液器內(nèi)部。將移液槍提離液面需停約1~3秒，觀察是否有液滴緩慢的流出。若有流出，說明有漏氣現(xiàn)象。放液吸頭緊貼容器壁放液。按鈕要待液體完全打出后再放松。正向：先將按鈕按至第一檔，略作停頓以后，再按至第二檔，這樣做可以確保吸液頭內(nèi)無殘留液體。反向：輕按按鈕至第一檔，排出液體。繼續(xù)按住按鈕，將留在吸頭中的多余液體返回

5、原來容器或隨吸頭丟棄。卸掉吸頭一般用力下按吸頭脫卸按紐即可卸掉吸頭。將吸頭丟棄到廢物收集器中。移液器如不使用，將刻度調(diào)到最大量程，使彈簧恢復(fù)原形，延長移液器的使用壽命。（一）實驗?zāi)康模?、使用專一的培養(yǎng)基（尿素為惟一氮源）分離專一的細(xì)菌（有脲酶的細(xì)菌）。2、使用指示劑（酚紅）顏色的變化檢知酶（脲酶）所催化的反應(yīng)。本實驗的內(nèi)容是：用尿素固體培養(yǎng)基從土壤中分離出能利用尿素的細(xì)菌，觀察菌落數(shù)；并以LB全營養(yǎng)固體培養(yǎng)基為對照，觀察全營養(yǎng)培養(yǎng)基上的菌落數(shù)。二、實驗內(nèi)容比較兩者的菌落數(shù)，可知能利用尿素的細(xì)菌在土

6、壤菌群中所占的比例（二）實驗原理：在土壤中，存在一些細(xì)菌，它們含有脲酶，能分解尿素(脲)作為其生長的氮源(NH3)1.利用尿素培養(yǎng)基(以尿素為惟一氮源的選擇培養(yǎng)基)，分離出土壤中含脲酶的細(xì)菌。2CO32NH2OH+????+脲酶22)(ONH=C二、實驗內(nèi)容2.細(xì)菌合成的脲酶能將尿素分解成NH3，致使PH升高，使酚紅指示劑變紅。二、實驗內(nèi)容（三）設(shè)備及用品：略（四）材料2、全營養(yǎng)LB固體培養(yǎng)基：蛋白胨、酵母提取物、NaCl、瓊脂糖、水。3、尿素固體培養(yǎng)基：葡萄糖、NaCl、K2HPO4、酚紅、瓊脂糖

7、、水、尿素。1、100mL燒杯：裝有50mL70%酒精，浸泡著玻璃刮刀6、土樣：從有哺乳動物排泄物的地方取（糞便中含尿素，利于含脲酶的微生物生長）4、5支有塞試管：盛有4.5mL蒸餾水5、250mL三角瓶：盛有90mL蒸餾水為什么要設(shè)置全營養(yǎng)LB固體培養(yǎng)基？起對照作用。土壤中含有多種細(xì)菌，在全營養(yǎng)LB培養(yǎng)基中，多數(shù)細(xì)菌都能生長；而在僅以尿素為氮源的培養(yǎng)基中，只有含有脲酶的微生物才能生長。1、為什么用瓊脂糖替代瓊脂作為固化劑？酚紅在此起什么作用？瓊脂是末被純化的混合物，內(nèi)含有一定量的含氮化合物。如果用

8、瓊脂固化培養(yǎng)基，會為細(xì)菌提供一定量的非尿素類氮源，這樣會在尿素固體培養(yǎng)基上產(chǎn)生大量以非尿素為氮源的細(xì)菌，不利于以尿素為氮源的細(xì)菌的篩選。酚紅為酸堿指示劑，在酸性環(huán)境呈黃色，在堿性環(huán)境呈紅色。通過酚紅的顏色變化，可檢測培養(yǎng)基中pH的變化。思考與練習(xí)：注意：取樣時盡量只取懸液。稱量—溶化—調(diào)PH—分裝—加塞封口—包扎—滅菌二、實驗內(nèi)容（五）實驗步驟：1、配制培養(yǎng)基并滅菌2、倒平板3、制備細(xì)菌懸液4、用涂布分離法分離細(xì)菌5、細(xì)菌培養(yǎng)6、觀察、對比全營養(yǎng)LB固體培養(yǎng)基和尿素固