adhgf對肺泡ⅱ型上皮細胞的轉(zhuǎn)染表達及增殖效應(yīng)

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1、AdHGF對肺泡Ⅱ型上皮細胞的轉(zhuǎn)染表達及增殖效應(yīng)作者：哈小琴，呂同德，趙治華，唐瑜，昌業(yè)偉【摘要】目的：觀察AdHGF對肺泡Ⅱ型上皮細胞（ATⅡ細胞）的轉(zhuǎn)染表達及增殖效應(yīng).方法：以不同轉(zhuǎn)染強度（50，100，200MOI）AdGFP轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)大鼠ATⅡ細胞，感染后48h用流式細胞儀檢測轉(zhuǎn)染效率.并以最佳感染強度AdHGF轉(zhuǎn)染ATⅡ細胞，ELISA方法檢測轉(zhuǎn)染后48,72h上清中HGF的表達水平.用MTT法檢測表達產(chǎn)物對肺泡上皮細胞的效應(yīng).結(jié)果：感染強度為100MOI時，對ATⅡ細胞的轉(zhuǎn)染效率已達89.61％，以

2、100MOI的AdHGF轉(zhuǎn)染6×105細胞后48,72h上清中HGF的表達分別為(249.4±1.8)ng和(168.0±26.1)ng，且表達產(chǎn)物對ATⅡ細胞有明顯的促增殖作用.結(jié)論：AdHGF可有效轉(zhuǎn)染ATⅡ細胞并在細胞中表達，表達產(chǎn)物對該細胞有明顯的促增殖作用.【關(guān)鍵詞】AdHGF；肺泡Ⅱ型上皮細胞；轉(zhuǎn)染；基因表達；細胞增殖0引言9　　肺泡上皮細胞是覆蓋于肺泡表面的一層上皮細胞，分為Ⅰ型和Ⅱ型.其中肺泡Ⅱ型上皮細胞(alveolartypeⅡcell,ATⅡ細胞)具有重要的功能,當(dāng)受到各種刺激時,ATⅡ細胞可

3、增生并修復(fù)已損傷的上皮細胞,起著肺泡上皮干細胞的作用［1］.肝細胞生長因子（hepatocytegrowthfactor,HGF）是一多功能生長因子，在生理狀態(tài)下可促進肺上皮細胞的發(fā)生、管腔形成及肺支氣管上皮細胞的增生，HGF也可促進急性肺損傷的肺上皮組織增生和修復(fù)［2］.我們在前期構(gòu)建的攜帶人HGF基因的重組腺病毒（AdHGF）［3］基礎(chǔ)上，觀察AdHGF對ATⅡ細胞的轉(zhuǎn)染表達及增殖效應(yīng)，為AdHGF治療肺損傷提供依據(jù).1材料和方法1.1材料AdHGF,攜帶綠色熒光蛋白基因的重組腺病毒（AdGFP）由軍事醫(yī)學(xué)

4、科學(xué)院二所三室提供，本課題組構(gòu)建［3］；抗人HGFmAb（R&D），重組人HGF蛋白純品（R&D）,DMEM(Gibco),胎牛血清(Gibco)，堿性磷酸酶顯色試劑（北京中山生物技術(shù)有限公司），MTT(BBI)；Wistar大鼠（甘肅省中醫(yī)學(xué)院，清潔級，180～230g）.1.2方法91.2.1大鼠ATⅡ細胞原代培養(yǎng)Wistar大鼠腹腔注射肝素（4U/g）和異戊巴比妥鈉（100mg/100g）,無菌分離出氣管及肺置于生理鹽水中，用生理鹽水沖洗肺動脈兩次后行肺支氣管插管，用8～15mL溶液A(1.3mmo

5、l/LNaCl,5.2mmol/LKCl,10.6mmol/LHepes,2.6mmol/LNa2HPO4,10mmol/LDGlucose,pH7.4)沖洗2～3次后，用2.5g/L胰酶沖洗1次，再將胰酶灌滿肺（約8～15mL）,37℃消化20～30min;剪碎肺組織置入含250mL/L胎牛血清的溶液B(A液加入1.9mmol/LCaCl2,1.29mmol/LMgSO4)中,37℃振搖4min后過100目和200目細胞篩,并用Percoll分離液進行低溫（10℃）梯度離心，250g離心20min，收集細胞接種于含1

6、00mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，37℃50mL/LCO2培養(yǎng)1h后將未貼細胞轉(zhuǎn)至另一培養(yǎng)瓶繼續(xù)培養(yǎng)，48h時對細胞進行堿性磷酸酶染色（改良Gomori氏鈣鈷法）［4］鑒定.1.2.2重組腺病毒對原代培養(yǎng)ATⅡ細胞的轉(zhuǎn)染將第二代生長旺盛的ATⅡ細胞接種至6孔細胞培養(yǎng)板，每孔6×105細胞，次日用不同感染強度（50，100，200MOI）的AdGFP感染，感染后48h用流式細胞儀檢測轉(zhuǎn)染效率，選擇對原代培養(yǎng)ATⅡ細胞的最佳感染強度.1.2.3腺病毒介導(dǎo)HGF在ATⅡ細胞中的表達將生長旺盛的原代培養(yǎng)ATⅡ細胞接種至6

7、孔細胞培養(yǎng)板，每孔6×105細胞，24h后用最佳感染強度的AdHGF感染，37℃培養(yǎng)48,72h時分別收集上清.9用ELISA檢測HGF表達量.1.2.4HGF表達產(chǎn)物對ATⅡ細胞的作用采用MTT法測定細胞增殖活性.將原代培養(yǎng)ATⅡ細胞接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔細胞數(shù)為5×103個.12h后吸棄原培養(yǎng)液，每孔加入100μL無血清DMEM,HGF表達上清所加的量分別占培養(yǎng)總體積的5%(80pg)，10%(160pg),15%(240pg),20%(320pg),25%(400pg),40%(640pg)和50%(80

8、0pg).72h后每孔加入20μLMTT,37℃孵育4h后，棄上清用DMSO溶解沉淀，測其波長在560nm處A值.2結(jié)果2.1原代培養(yǎng)大鼠ATⅡ細胞酶消化及貼壁培養(yǎng)法培養(yǎng)大鼠ATⅡ細胞，48h對細胞進行堿性磷酸酶染色，胞質(zhì)中可見灰黑以至深黑顆粒狀沉淀(圖1).2.2重組腺病毒可有效轉(zhuǎn)染ATⅡ細胞以不同MOI的AdG