adhgf對(duì)肺泡ⅱ型上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)染表達(dá)及增殖效應(yīng)

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1、AdHGF對(duì)肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)染表達(dá)及增殖效應(yīng)作者：哈小琴，呂同德，趙治華，唐瑜，昌業(yè)偉【摘要】目的：觀察AdHGF對(duì)肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞（ATⅡ細(xì)胞）的轉(zhuǎn)染表達(dá)及增殖效應(yīng).方法：以不同轉(zhuǎn)染強(qiáng)度（50，100，200MOI）AdGFP轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)大鼠ATⅡ細(xì)胞，感染后48h用流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率.并以最佳感染強(qiáng)度AdHGF轉(zhuǎn)染ATⅡ細(xì)胞，ELISA方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后48,72h上清中HGF的表達(dá)水平.用MTT法檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物對(duì)肺泡上皮細(xì)胞的效應(yīng).結(jié)果：感染強(qiáng)度為100MOI時(shí)，對(duì)ATⅡ細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率已達(dá)89.61％，以100MOI的AdHGF轉(zhuǎn)染6×105細(xì)胞后48,7

2、2h上清中HGF的表達(dá)分別為(249.4±1.8)ng和(168.0±26.1)ng，且表達(dá)產(chǎn)物對(duì)ATⅡ細(xì)胞有明顯的促增殖作用.結(jié)論：AdHGF可有效轉(zhuǎn)染ATⅡ細(xì)胞并在細(xì)胞中表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物對(duì)該細(xì)胞有明顯的促增殖作用.【關(guān)鍵詞】AdHGF；肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞；轉(zhuǎn)染；基因表達(dá)；細(xì)胞增殖0引言　　肺泡上皮細(xì)胞是覆蓋于肺泡表面的一層上皮細(xì)胞，分為Ⅰ型和Ⅱ型.其中肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞(alveolartypeⅡcell,ATⅡ細(xì)胞)具有重要的功能,當(dāng)受到各種刺激時(shí),ATⅡ細(xì)胞可增生并修復(fù)已損傷的上皮細(xì)胞,起著肺泡上皮干細(xì)胞的作用［1］.肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（hepatocytegroAb（R

3、D），重組人HGF蛋白純品（RD）,DMEM(Gibco),胎牛血清(Gibco)，堿性磷酸酶顯色試劑（北京中山生物技術(shù)有限公司），MTT(BBI)；gSO4)中,37℃振搖4min后過100目和200目細(xì)胞篩,并用Percoll分離液進(jìn)行低溫（10℃）梯度離心，250g離心20min，收集細(xì)胞接種于含100mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，37℃50mL/LCO2培養(yǎng)1h后將未貼細(xì)胞轉(zhuǎn)至另一培養(yǎng)瓶繼續(xù)培養(yǎng)，48h時(shí)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行堿性磷酸酶染色（改良Gomori氏鈣鈷法）［4］鑒定.1.2.2重組腺病毒對(duì)原代培養(yǎng)ATⅡ細(xì)胞的轉(zhuǎn)染將第二代生長(zhǎng)旺盛的ATⅡ細(xì)胞接種至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板

4、，每孔6×105細(xì)胞，次日用不同感染強(qiáng)度（50，100，200MOI）的AdGFP感染，感染后48h用流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率，選擇對(duì)原代培養(yǎng)ATⅡ細(xì)胞的最佳感染強(qiáng)度.1.2.3腺病毒介導(dǎo)HGF在ATⅡ細(xì)胞中的表達(dá)將生長(zhǎng)旺盛的原代培養(yǎng)ATⅡ細(xì)胞接種至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔6×105細(xì)胞，24h后用最佳感染強(qiáng)度的AdHGF感染，37℃培養(yǎng)48,72h時(shí)分別收集上清.用ELISA檢測(cè)HGF表達(dá)量.1.2.4HGF表達(dá)產(chǎn)物對(duì)ATⅡ細(xì)胞的作用采用MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖活性.將原代培養(yǎng)ATⅡ細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔細(xì)胞數(shù)為5×103個(gè).12h后吸棄原培養(yǎng)液，每孔加入100μL

5、無(wú)血清DMEM,HGF表達(dá)上清所加的量分別占培養(yǎng)總體積的5%(80pg)，10%(160pg),15%(240pg),20%(320pg),25%(400pg),40%(640pg)和50%(800pg).72h后每孔加入20μLMTT,37℃孵育4h后，棄上清用DMSO溶解沉淀，測(cè)其波長(zhǎng)在560nm處A值.2結(jié)果2.1原代培養(yǎng)大鼠ATⅡ細(xì)胞酶消化及貼壁培養(yǎng)法培養(yǎng)大鼠ATⅡ細(xì)胞，48h對(duì)細(xì)胞進(jìn)行堿性磷酸酶染色，胞質(zhì)中可見灰黑以至深黑顆粒狀沉淀(圖1).2.2重組腺病毒可有效轉(zhuǎn)染ATⅡ細(xì)胞以不同MOI的AdGFP（50,100,200pfu/細(xì)胞）感染ATⅡ細(xì)胞，隨著病毒劑

6、量的加大，其轉(zhuǎn)染率提高（圖2）.當(dāng)MOI為100pfu/細(xì)胞時(shí)，轉(zhuǎn)染率已近90%，表明ATⅡ細(xì)胞對(duì)重組腺病毒高度敏感；當(dāng)MOI再加大時(shí)，腺病毒對(duì)細(xì)胞有一定毒性，細(xì)胞有少量漂浮現(xiàn)象.ATⅡ細(xì)胞感染AdGFP12h時(shí)，即可在熒光顯微鏡下觀察到大量GFP表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞，隨時(shí)間的推移，陽(yáng)性細(xì)胞比例繼續(xù)增多，GFP表達(dá)量也升高，48～72h時(shí)達(dá)高峰（圖3），此后GFP表達(dá)量呈下降趨勢(shì)，直至第10日時(shí)仍可見少量陽(yáng)性細(xì)胞.2.3重組腺病毒介導(dǎo)人HGF基因在肺泡上皮細(xì)胞中的表達(dá)用ELISA方法檢測(cè)AdHGF感染肺泡上皮細(xì)胞后HGF的表達(dá)，結(jié)果感染后48h表達(dá)量約為(249.4±1.8)

7、ng/6×105細(xì)胞；至72h時(shí)仍有較高的表達(dá)［（168.0±26.1）ng/6×105細(xì)胞］.這說明腺病毒介導(dǎo)的人HGF基因可在肺泡上皮細(xì)胞中高效表達(dá).2.4HGF表達(dá)產(chǎn)物對(duì)ATⅡ細(xì)胞的增殖刺激活性采用MTT法分析了不同劑量HGF表達(dá)產(chǎn)物對(duì)原代培養(yǎng)ATⅡ細(xì)胞的作用，結(jié)果表明原代培養(yǎng)ATⅡ細(xì)胞表達(dá)的上清，有明顯刺激ATⅡ細(xì)胞增殖的活性(P<0.05)，而且有劑量效應(yīng)關(guān)系.加入20%（320pg）表達(dá)上清時(shí)刺激活性達(dá)高峰，劑量加大活性不再增加(圖4).3討論　　肺泡Ⅰ型上皮細(xì)胞(ATⅠ細(xì)胞)和ATⅡ細(xì)胞連接于同