AdHGF對(duì)肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)染表達(dá)及增殖效應(yīng).doc

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1、AdHGF對(duì)肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)染表達(dá)及增殖效應(yīng)作者：哈小琴，呂同德，趙治華，唐瑜，昌業(yè)偉【摘要】目的：觀察AdHGF對(duì)肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞（ATⅡ細(xì)胞）的轉(zhuǎn)染表達(dá)及增殖效應(yīng).方法：以不同轉(zhuǎn)染強(qiáng)度（50，100，200MOI）AdGFP轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)大鼠ATⅡ細(xì)胞，感染后48h用流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率.并以最佳感染強(qiáng)度AdHGF轉(zhuǎn)染ATⅡ細(xì)胞，ELISA方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后48,72h上清中HGF的表達(dá)水平.用MTT法檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物對(duì)肺泡上皮細(xì)胞的效應(yīng).結(jié)果：感染強(qiáng)度為100MOI時(shí)，對(duì)ATⅡ細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率已達(dá)89.61％，以100MOI的AdHGF轉(zhuǎn)染6×105細(xì)胞后48,72h上清中

2、HGF的表達(dá)分別為(249.4±1.8)ng和(168.0±26.1)ng，且表達(dá)產(chǎn)物對(duì)ATⅡ細(xì)胞有明顯的促增殖作用.結(jié)論：AdHGF可有效轉(zhuǎn)染ATⅡ細(xì)胞并在細(xì)胞中表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物對(duì)該細(xì)胞有明顯的促增殖作用.【關(guān)鍵詞】AdHGF；肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞；轉(zhuǎn)染；基因表達(dá)；細(xì)胞增殖0引言　　肺泡上皮細(xì)胞是覆蓋于肺泡表面的一層上皮細(xì)胞，分為Ⅰ型和Ⅱ型.其中肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞(alveolartypeⅡcell,ATⅡ細(xì)胞)具有重要的功能,當(dāng)受到各種刺激時(shí),ATⅡ細(xì)胞可增生并修復(fù)已損傷的上皮細(xì)胞,起著肺泡上皮干細(xì)胞的作用［1］.肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（hepatocytegrowthfactor,HGF）

3、是一多功能生長(zhǎng)因子，在生理狀態(tài)下可促進(jìn)肺上皮細(xì)胞的發(fā)生、管腔形成及肺支氣管上皮細(xì)胞的增生，HGF也可促進(jìn)急性肺損傷的肺上皮組織增生和修復(fù)［2］.我們?cè)谇捌跇?gòu)建的攜帶人HGF基因的重組腺病毒（AdHGF）［3］基礎(chǔ)上，觀察AdHGF對(duì)ATⅡ細(xì)胞的轉(zhuǎn)染表達(dá)及增殖效應(yīng)，為AdHGF治療肺損傷提供依據(jù).1材料和方法1.1材料AdHGF,攜帶綠色熒光蛋白基因的重組腺病毒（AdGFP）由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院二所三室提供，本課題組構(gòu)建［3］；抗人HGFmAb（R&D），重組人HGF蛋白純品（R&D）,DMEM(Gibco),胎牛血清(Gibco)，堿性磷酸酶顯色試劑（北京中山生

4、物技術(shù)有限公司），MTT(BBI)；Wistar大鼠（甘肅省中醫(yī)學(xué)院，清潔級(jí)，180～230g）.1.2方法1.2.1大鼠ATⅡ細(xì)胞原代培養(yǎng)Wistar大鼠腹腔注射肝素（4U/g）和異戊巴比妥鈉（100mg/1004g）,無(wú)菌分離出氣管及肺置于生理鹽水中，用生理鹽水沖洗肺動(dòng)脈兩次后行肺支氣管插管，用8～15mL溶液A(1.3mmol/LNaCl,5.2mmol/LKCl,10.6mmol/LHepes,2.6mmol/LNa2HPO4,10mmol/LDGlucose,pH7.4)沖洗2～3次后，用2.5g/L胰酶沖洗1次，再將胰酶灌滿(mǎn)肺（約8～15mL）,37℃消化20～30mi

5、n;剪碎肺組織置入含250mL/L胎牛血清的溶液B(A液加入1.9mmol/LCaCl2,1.29mmol/LMgSO4)中,37℃振搖4min后過(guò)100目和200目細(xì)胞篩,并用Percoll分離液進(jìn)行低溫（10℃）梯度離心，250g離心20min，收集細(xì)胞接種于含100mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，37℃50mL/LCO2培養(yǎng)1h后將未貼細(xì)胞轉(zhuǎn)至另一培養(yǎng)瓶繼續(xù)培養(yǎng)，48h時(shí)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行堿性磷酸酶染色（改良Gomori氏鈣鈷法）［4］鑒定.1.2.2重組腺病毒對(duì)原代培養(yǎng)ATⅡ細(xì)胞的轉(zhuǎn)染將第二代生長(zhǎng)旺盛的ATⅡ細(xì)胞接種至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔6×105細(xì)胞，次日用不同感染強(qiáng)度（50，

6、100，200MOI）的AdGFP感染，感染后48h用流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率，選擇對(duì)原代培養(yǎng)ATⅡ細(xì)胞的最佳感染強(qiáng)度.1.2.3腺病毒介導(dǎo)HGF在ATⅡ細(xì)胞中的表達(dá)將生長(zhǎng)旺盛的原代培養(yǎng)ATⅡ細(xì)胞接種至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔6×105細(xì)胞，24h后用最佳感染強(qiáng)度的AdHGF感染，37℃培養(yǎng)48,72h時(shí)分別收集上清.用ELISA檢測(cè)HGF表達(dá)量.1.2.4HGF表達(dá)產(chǎn)物對(duì)ATⅡ細(xì)胞的作用采用MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖活性.將原代培養(yǎng)ATⅡ細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔細(xì)胞數(shù)為5×103個(gè).12h后吸棄原培養(yǎng)液，每孔加入100μL無(wú)血清DMEM,HGF表達(dá)上清所加的量分別占培養(yǎng)總體積的5

7、%(80pg)，10%(160pg),15%(240pg),20%(320pg),25%(400pg),40%(640pg)和50%(800pg).72h后每孔加入20μLMTT,37℃孵育4h后，棄上清用DMSO溶解沉淀，測(cè)其波長(zhǎng)在560nm處A值.2結(jié)果2.1原代培養(yǎng)大鼠ATⅡ細(xì)胞酶消化及貼壁培養(yǎng)法培養(yǎng)大鼠ATⅡ細(xì)胞，48h對(duì)細(xì)胞進(jìn)行堿性磷酸酶染色，胞質(zhì)中可見(jiàn)灰黑以至深黑顆粒狀沉淀(圖1).2.2重組腺病毒可有效轉(zhuǎn)染ATⅡ細(xì)胞以不同MOI的AdGFP