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1、HPLC法測定甲腫消及大鼠血清中土貝母苷甲的含量作者：崔翰明,程慧平,劉喜明,朱曉蕓【摘要】目的建立甲腫消制劑及灌胃給予甲腫消后大鼠血清中土貝母苷甲的含量測定方法。方法采用RP-HPLC法,甲腫消制劑用甲醇萃取,血清樣品采用C18SPE固相萃取柱(3mL,200mg,60μm)處理,甲醇洗脫；色譜柱：DiamonsilC18(250mm×4.6mm,5μm)和Easyguard保護柱；流動相：甲醇-水(65∶35),檢測波長：214nm,流速：1mL/min。結(jié)果甲腫消制劑及大鼠血清中土貝母苷甲的回收率分別為(103.49±3.49)%、(104.70±4.69)%,土貝母苷甲在1.18～88
2、.5μg/mL濃度范圍內(nèi)線性良好。每1g制劑含土貝母苷甲995.3μg,灌胃給予甲腫消后大鼠血清中土貝母苷甲濃度為3.19μg/mL。結(jié)論本方法快速、簡便、準(zhǔn)確,可用于測定制劑及其血清中土貝母苷甲的含量?！娟P(guān)鍵詞】甲腫消；土貝母苷甲；固相萃??；反相高效液相色譜法；含藥血清；含量測定Keywords：Jiazhongxiao；TubeimosideⅠ；SPE；RP-HPLC；drugcontainingserum；determination甲腫消處方由夏枯草、土貝母等組成,按適當(dāng)工藝制成濃度為37g/mL原藥材的浸膏劑。動物和臨床試驗證明,該制劑具有較好的化痰散結(jié)、治療甲狀腺功能亢進型甲狀腺腫大
3、的作用。但其作用途徑與機理尚不清楚,故我們采用血清藥理學(xué)的方法,觀察本制劑大鼠灌胃給藥后的含藥血清對甲狀腺細(xì)胞增殖的影響,以闡明本方治療甲狀腺功能亢進的機理。土貝母為葫蘆科植物土貝母[Bolbostemmapaniculatum(Maxim.)Franquet]的干燥塊莖,有散結(jié)、消腫、解毒之功效。從中分離出的土貝母苷甲是其主要有效成分,具有抗腫瘤、抗病毒、免疫抑制等多種活性[1]。因此,我們采用RP-HPLC法建立了大鼠含藥血清中的代表性成分土貝母苷甲(土貝母)的含量測定方法,為進一步闡明本方治療甲狀腺功能亢進的機理提供分析方法?！ ?儀器與試藥LC-10A高效液相色譜儀和SPD-10A紫外
4、檢測器(日本導(dǎo)津公司)；XW-80A渦旋混合器；PHS-25型酸度計；TGL-16g臺式高速離心機；ME215P型分析天平(Sartorius)；DiamonsilC18分析柱(250mm×4.6mm,5μm)；Easyguard保護柱(迪馬公司)；固相萃取小柱(C18SPE,200mg,3mL,瓦里安公司)。體重(330±10)g的雄性Wister大鼠(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物中心,合格證號：SCXK-2005-0013)。夏枯草、土貝母等藥材購自燕京飲片廠,由本院藥理實驗室鑒定,符合2005版《中華人民共和國藥典》標(biāo)準(zhǔn)；土貝母苷甲(批號1536-200001)對照品由中國藥品生物制品檢定所提供。
5、甲醇、乙腈等試劑均為色譜用；水為高純水。7 2方法與結(jié)果 2.1含藥血清的制備 2.1.1甲腫消制劑的制備 按處方量配制,水煎煮提取,過濾,濾液減壓濃縮后得濃度為每毫升相當(dāng)于3g原藥材的浸膏劑?！ ?.1.2大鼠含藥血清的制備 選取體重(330±10)g的雄性Wistar大鼠30只,其中20只按體重5mL/kg的劑量灌胃給予甲腫消浸膏劑,10只按體重給予同劑量生理鹽水,每天2次,連續(xù)7d。末次灌胃后開始計時,于60min后,用玻璃毛細(xì)管自乙醚麻醉大鼠眼底采血,收集血樣于離心試管中,放置2h促凝,1500r/min離心10min,吸取上清液,0.22μm濾膜過濾,濾液即為含藥血清和空白
6、血清,-20℃冷凍保存。 2.2甲腫消和大鼠含藥血清中土貝母苷甲的含量測定 2.2.1甲腫消樣品的前處理7 精密稱取甲腫消浸膏約3g,分別用甲醇(15、15、10mL)超聲(300W,55kHz)提取3次,每次5min,0.45μm濾膜過濾,合并濾液,加甲醇定容至50mL。精密量取10mL,減壓除去溶劑,殘渣精密加入甲醇2mL,超聲溶解,0.45μm濾膜過濾,取續(xù)濾液作為含量測試試液?！ ?.2.2血清樣品中土貝母苷甲的前處理 凍存血清于室溫解凍備用。選取C18SPE柱(200mg,3mL,60μm),先用2mL甲醇沖洗,再用2mL純水沖洗活化；精密量取血清1mL上樣,棄去流出液,用2
7、mL純水沖洗,再用1mL甲醇洗脫,收集甲醇洗脫液作為供試液?！ ?.2.3色譜條件 色譜柱：DiamonsilC18(250mm×4.6mm,5μm)和Easyguard保護柱；流動相：甲醇-水(65∶35)；流速：1mL/min；檢測波長：214nm；進樣10μL。色譜圖見圖1。 2.2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定 精密稱取土貝母苷甲標(biāo)準(zhǔn)品11.8mg,用65%甲醇配成濃度為118μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶
