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1、HPLC法測(cè)定甲腫消及大鼠血清中土貝母苷甲的含量甲腫消處方由夏枯草、土貝母等組成,按適當(dāng)工藝制成濃度為3g/mL原藥材的浸膏劑。動(dòng)物和臨床試驗(yàn)證明,該制劑具有較好的化痰散結(jié)、治療甲狀腺功能亢進(jìn)型甲狀腺腫大的作用。但其作用途徑與機(jī)理尚不清楚,故我們采用血清藥理學(xué)的方法,觀察本制劑大鼠灌胃給藥后的含藥血清對(duì)甲狀腺細(xì)胞增殖的影響,以闡明本方治療甲狀腺功能亢進(jìn)的機(jī)理。土貝母為葫蘆科植物土貝母[Bolbostemmapaniculatum(Maxim.)Franquet]的干燥塊莖,有散結(jié)、消腫、解毒之功效。從中分離出的土貝母苷甲是其主要有效成分,具有抗腫瘤、抗病毒、免疫抑制等多種活性[1]
2、。因此,我們采用RP-HPLC法建立了大鼠含藥血清中的代表性成分土貝母苷甲(土貝母)的含量測(cè)定方法,為進(jìn)一步闡明本方治療甲狀腺功能亢進(jìn)的機(jī)理提供分析方法?！ ?儀器與試藥LC-10A高效液相色譜儀和SPD-10A紫外檢測(cè)器(日本導(dǎo)津公司)；XE215P型分析天平(Sartorius)；DiamonsilC18分析柱(250mm×4.6mm,5μm)；Easyguard保護(hù)柱(迪馬公司)；固相萃取小柱(C18SPE,200mg,3mL,瓦里安公司)。體重(330±10)g的雄性L/kg的劑量灌胃給予甲腫消浸膏劑,10只按體重給予同劑量生理鹽水,每天2次,連續(xù)7d。末次灌胃后開始計(jì)時(shí),
3、于60min后,用玻璃毛細(xì)管自乙醚麻醉大鼠眼底采血,收集血樣于離心試管中,放置2h促凝,1500r/min離心10min,吸取上清液,0.22μm濾膜過濾,濾液即為含藥血清和空白血清,-20℃冷凍保存?！ ?.2甲腫消和大鼠含藥血清中土貝母苷甲的含量測(cè)定 2.2.1甲腫消樣品的前處理 精密稱取甲腫消浸膏約3g,分別用甲醇(15、15、10mL)超聲(300in,0.45μm濾膜過濾,合并濾液,加甲醇定容至50mL。精密量取10mL,減壓除去溶劑,殘?jiān)芗尤爰状?mL,超聲溶解,0.45μm濾膜過濾,取續(xù)濾液作為含量測(cè)試試液?！ ?.2.2血清樣品中土貝母苷甲的前處理 凍存血
4、清于室溫解凍備用。選取C18SPE柱(200mg,3mL,60μm),先用2mL甲醇沖洗,再用2mL純水沖洗活化；精密量取血清1mL上樣,棄去流出液,用2mL純水沖洗,再用1mL甲醇洗脫,收集甲醇洗脫液作為供試液。護(hù)理論文發(fā)表 2.2.3色譜條件 色譜柱：DiamonsilC18(250mm×4.6mm,5μm)和Easyguard保護(hù)柱；流動(dòng)相：甲醇-水(65∶35)；流速：1mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：214nm；進(jìn)樣10μL。色譜圖見圖1。2.2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定 精密稱取土貝母苷甲標(biāo)準(zhǔn)品11.8mg,用65%甲醇配成濃度為118μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液,然后分別用65%甲醇稀
5、釋制成土貝母苷甲濃度為14.75、29.5、59、88.5、118μg/mL,按“2.2.3”項(xiàng)色譜條件測(cè)定。以土貝母苷甲的峰面積A和濃度C作圖,進(jìn)行線形回歸,得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：A＝2503.1C－2300.5,R2＝0.9996,土貝母苷甲在14.75～118μg/mL的濃度范圍內(nèi)線性良好?！ ∪⊥霖惸杠占诐舛葹?18μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別精密量取一定量,加入空白血清,使土貝母苷甲濃度為1.18、2.36、11.8、14.75、29.5、59、88.5μg/mL,按“2.2.2”和“2.2.3”項(xiàng)操作,記錄土貝母苷甲的峰面積。以峰面積A和濃度C作圖,進(jìn)行線形回歸,得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程
6、：A＝2458.2C＋2127.8,R2＝0.9993,血清樣品中土貝母苷甲在1.18～88.5μg/mL的濃度范圍內(nèi)線性良好。 2.2.5精密度和回收率測(cè)定 取土貝母苷甲濃度為59μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液,按“2.2.3”項(xiàng)色譜條件測(cè)定3次。將峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程,計(jì)算土貝母苷甲的濃度為(59.40±2.00)μg/mL,與配制濃度比較,計(jì)算精密度,RSD＝3.39%。取土貝母苷甲標(biāo)準(zhǔn)溶液加入空白制劑中,制成濃度為59μg/mL的樣品溶液,分別按“2.2.1”和“2.2.3”項(xiàng)操作,測(cè)定3次。將峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程,計(jì)算土貝母苷甲的濃度,計(jì)算回收率為(103.49±3.49)
7、%。取土貝母苷甲標(biāo)準(zhǔn)溶液加入空白血清中,制成濃度為29.5μg/mL的血清樣品溶液,按“2.2.2”和“2.2.3”項(xiàng)操作,記錄土貝母苷甲的峰面積。將峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算濃度,與配制濃度比較,平均回收率為(104.70±4.69)%(n＝3)?！ ?.2.6甲腫消和大鼠血清樣品中土貝母苷甲含量的測(cè)定護(hù)理論文發(fā)表 精密稱取甲腫消浸膏3.086g,按“2.2.1”和“2.2.3”項(xiàng)操作；精密量取灌胃給予甲腫消后的大鼠血清1mL,按“2.2.2”和“2.2.3”項(xiàng)操
