人骨肉瘤mg63多藥耐藥細(xì)胞亞系建立及生物學(xué)特性分析

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1、人骨肉瘤MG63多藥耐藥細(xì)胞亞系建立及生物學(xué)特性分析作者：劉巖張德寶楊華　孫大輝【摘要】目的建立阿霉素(DXR)誘導(dǎo)的人成骨肉瘤MG63多藥耐藥細(xì)胞株亞系MG63/DXR10、MG63/DXR40、MG63/DXR100并觀察其生物學(xué)特性。方法以DXR為誘導(dǎo)劑，采用逐步增加劑量的方法誘導(dǎo)MG63細(xì)胞，建立多藥耐藥細(xì)胞株亞系MG63/DXR10、MG63/DXR40、MG63/DXR100;MTT法檢測(cè)藥物敏感性;光鏡、透射電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)變化，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期、凋亡指數(shù)。結(jié)果(1)經(jīng)DXR6個(gè)月

2、的誘導(dǎo)建立了MG63/DXR細(xì)胞株亞系。(2)MG63/DXR對(duì)DXR的耐藥指數(shù)為76.87，對(duì)長(zhǎng)春新堿、氨甲蝶呤、環(huán)磷酰胺亦產(chǎn)生不同程度的交叉耐藥。(3)光鏡觀察可見：MG63細(xì)胞排列規(guī)則，形態(tài)呈梭形，大小一致;MG63/DXR細(xì)胞株亞系排列不規(guī)則，大小不均，形態(tài)呈三角形、多角形及多核現(xiàn)象。透射電鏡顯示：MG63細(xì)胞膜平滑，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)較豐富;MG63/DXR細(xì)胞株亞系細(xì)胞表面突起增加，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富，胞質(zhì)內(nèi)可見髓樣小體、溶酶體及大量糖原池。(4)MG63細(xì)胞與其多藥耐藥細(xì)胞株亞系MG63/DXR10、MG63/DXR40、MG

3、63/DXR100細(xì)胞生長(zhǎng)曲線相近。(5)細(xì)胞周期分析顯示MG63、MG63/DXR10、MG63/DXR40、MG63/DXR100細(xì)胞G0/G1期分別為86.34%、83.67%、78.11%、68.81%;G2/M期分別為5.92%、7.45%、7.78%、10.90%;S期分別為107.74%、8.87%、14.11%、20.30%;而MG63/DXR與MG63細(xì)胞的凋亡指數(shù)無顯著差異。結(jié)論(1)小劑量DXR為誘導(dǎo)劑建立了人骨肉瘤多藥耐藥細(xì)胞株亞系(MG63/DXR10、MG63/DXR40、MG63/DXR100)，M

4、G63/DXR、MG63/DXR細(xì)胞對(duì)于甲氨蝶呤、長(zhǎng)春新堿、環(huán)磷酰胺產(chǎn)生不同程度交叉耐藥。(2)MG63/DXR細(xì)胞株亞系細(xì)胞形態(tài)、超微結(jié)構(gòu)、細(xì)胞周期分布與母系細(xì)胞MG63有顯著差異，凋亡指數(shù)無顯著差異。(3)MG63/DXR耐藥細(xì)胞的存在及其分裂、增殖可能是導(dǎo)致骨肉瘤化療失敗和腫瘤局部復(fù)發(fā)的原因之一?！娟P(guān)鍵詞】骨肉瘤;阿霉素;多藥耐藥;細(xì)胞周期骨肉瘤是一種好發(fā)于長(zhǎng)骨干骺端的惡性腫瘤。Rosen〔1〕提出新輔助化療(neoadjuvantchemoherpy)的廣泛應(yīng)用，使骨肉瘤的5年生存率已達(dá)60%以上，但惡性腫瘤化療后多藥耐

5、藥(multidrugresistance,MDR)現(xiàn)象仍是影響腫瘤患者化療療效和預(yù)后的主要因素之一。本研究以人成骨肉瘤細(xì)胞株MG63為誘導(dǎo)對(duì)象，分析其生物學(xué)特性?！　?材料與方法　　1.1材料人骨肉瘤細(xì)胞株MG63購(gòu)自上海中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。阿霉素(DXR，汕頭明治醫(yī)藥有限公司)、DMEM(Gibco)、小牛血清(Calf10Serum)(Gibco)、胰蛋白酶(Promega)、EDTA(Promega)、二甲基亞砜(DMSO)(Sigma)。CO2孵箱(SANYOMCO17AIC，日本)、超凈工作臺(tái)(YZ875)蘇凈集團(tuán)

6、安泰公司，倒置顯微鏡(OLYMPUS，日本)?！　?.2方法　　1.2.1主要溶液的配制DMEM溶液：用950ml去離子水溶解DMEM粉末13.4g，加入NaHCO33.7g，HEPES2.38g，調(diào)pH至7.4，加入青霉素和鏈霉素，使最終使用濃度分別為100U/ml和100μg/ml，使用時(shí)加入胎牛血清至終濃度為10%。0.25%胰蛋白酶0.02%EDTA：稱取0.2gEDTA，用去離子水溶解后，加入2.5g胰蛋白酶，定容至1000ml。　　1.2.2MG63培養(yǎng)與傳代MG63骨肉瘤細(xì)胞在含有10%小牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)

7、液(含青霉素100U/ml，鏈霉素100μg/ml)中培養(yǎng)。隔日換液1次。約3d長(zhǎng)滿后傳代。按1∶3～5傳代，繼續(xù)培養(yǎng)?！　?.2.3MG63多藥耐藥細(xì)胞株亞系的建立DXR加藥濃度的確定：取96孔板，每孔接種5×103個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24h后分別加入終濃度為0.1、0.4、1.0、4.0、10.0、40.0、100.0ng/ml的DXR。繼續(xù)培養(yǎng)48h，觀察細(xì)胞存活情況，確定起始加藥DXR終濃度為1.0ng/ml。傳代后將細(xì)胞分成實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組加入DXR終濃度1.0ng/ml，24h后換液，約3d細(xì)胞長(zhǎng)滿傳代。對(duì)照組不加DX

8、R，繼續(xù)培養(yǎng)，約310d傳代。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞穩(wěn)定生長(zhǎng)后，逐漸加大DXR濃度，依次為4.0、10.0、40.0、100.0ng/ml，每個(gè)濃度梯度持續(xù)1個(gè)月，細(xì)胞傳代后穩(wěn)定生長(zhǎng)。整個(gè)誘導(dǎo)過程6個(gè)月，傳代48次。將終濃度為10.0、40.0、100.0ng/ml的細(xì)胞分