固相萃取反相高效液相色譜熒光檢測法測定擬南芥中的生長素

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1、固相萃取反相高效液相色譜熒光檢測法測定擬南芥中的生長素作者：符繼紅褚金芳王吉德閆存玉【摘要】建立了固相萃取反相高效液相色譜熒光檢測法測定擬南芥中生長素的方法。采用WaterssunfireC18(150mm×4.6mm,5μm)色譜柱，以乙腈10mmol/L乙酸鈉(20∶80，V/V，乙酸調節(jié)至pH3.5)為流動相，在流速1mL/min，進樣量20μL，柱溫20℃，樣品溫度10℃，熒光激發(fā)和發(fā)射波長分別為275和345nm條件下，分離測定了擬南芥中的植物生長素吲哚乙酸和吲哚丙酸含量。分離效果良好，線性范圍分別為85.71p

2、g～21.43ng和0.33ng～1.29μg,相關系數(shù)分別為0.9992和0.9999，相對標準偏差小于5%，平均回收率分別為103.8%和102.6%。本方法可對少量模式植物樣品進行靈敏、準確的定量分析?！娟P鍵詞】固相萃取，生長素，吲哚乙酸，吲哚丙酸，擬南芥，高效液相色譜　1引言11　　植物激素是在植物體內某一部位合成，并可轉移到其它部位，調節(jié)植物生長發(fā)育具有顯著的微量有機物。植物激素在植物生長發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用[1]。植物功能基因對植物生長發(fā)育起到的精細調控作用通常以植物激素的形式體現(xiàn)出來,植物激素含量的微小變化

3、就能夠引起植物明顯的生理變化，對其進行提取和測定非常困難。生長素是最早發(fā)現(xiàn)的一種植物激素，主要功能是促進植物生長、細胞分裂和分化[2]。由于其在植物體內含量甚微，所以從少量樣品中分離測定生長素具有重要的意義。　　近年來，檢測植物激素主要采用氣相色譜質譜聯(lián)用(GCMS)和液相色譜質譜聯(lián)用(LCMS)技術。但是GCMS方法要求樣品的衍生化以提高揮發(fā)性和靈敏度，樣品處理過程復雜費時。LCMS/MS技術雖然有較高的靈敏度和選擇性，同位素內標物的使用使其定量更為準確[3～7]。但由于儀器和內標物的昂貴，限制了該方法的廣泛應

4、用。高效液相色譜(HPLC)是一種通用的分析儀器，其在植物激素測定研究中已有報道，但因生物體內激素的復雜性與特殊性，使其有效成分的提取分離成為極為關鍵的一步。HPLC法測定多種植物內源激素時經(jīng)常發(fā)生分離差、峰型不良及嚴重拖尾現(xiàn)象[8]，且樣品用量一般要求較多[9,10]，對一些特殊樣品無法實現(xiàn)測試要求。因此，選擇合適的植物激素提取方法和色譜條件尤為重要。　　本研究建立的固相萃取高效液相色譜(HPLC)熒光檢測法可以準確測定植物中的生長素類物質，樣品用量少，可以滿足普通分析實驗室完成相關測試的要求。擬南芥(Arabidopsi

5、s11thaliana)屬被子植物，雙子葉分綱，屬十字花科。因其具有生命周期短、自花授粉、核基因組小，結構簡單等優(yōu)點，是植物細胞遺傳學研究的經(jīng)典模式材料[11]。建立擬南芥中植物激素生長素含量的測定方法對有關生長素作用機制及信號轉導途徑的研究具有重要意義?！　?實驗部分　　2.1儀器與試劑　　2695高效液相色譜儀(美國Waters公司)，配備WatersEmpower化學工作站、Waters2475熒光檢測器、WaterssunfireC18色譜柱(150mm×4.6mm,5μm)、C18固相萃取小柱;旋轉蒸發(fā)儀(德國He

6、idolph公司);HimacCR22G高速離心機(日本日立公司)。乙腈(色譜純，F(xiàn)isher公司);乙酸鈉(分析純，北京化工廠);乙酸(分析純，國藥集團化學試劑有限公司);吲哚乙酸(IAA)和吲哚丙酸(IPA)生長素標準品(Sigma公司);銅試劑(二乙基二硫代氨基甲酸鈉，純度≥99.0%，Sigma公司);實驗用水為ULTRAANMK2超純水儀(ELGA公司)制備的超純水;擬南芥(中科院遺傳與發(fā)育生物學研究所種植，生長期12d，長日照，16h光照，8h黑暗。溫度21～23℃，濕度50%～60%，光照強度80～120μmo

7、l/(s·m2)?！　?.2實驗方法11　　2.2.1標準溶液的配制根據(jù)擬南芥中生長素含量范圍確定標樣濃度[9]。準確稱取0.05357g吲哚乙酸和0.06458g吲哚丙酸，用80%甲醇溶解并定容至25mL，配制成2.14g/L吲哚乙酸和2.58g/L吲哚丙酸標準溶液。相應低濃度生長素標準液用80%甲醇稀釋而成?！　?.2.2色譜條件WaterssunfireC18色譜柱(150mm×4.6mm,5μm);流動相：乙腈10mmol/L乙酸鈉(20:80，V/V，乙酸調節(jié)至pH3.5);流速1mL/min，進樣量20μL。柱

8、溫20℃;樣品溫度10℃;熒光激發(fā)和發(fā)射波長分別為275和345nm?！　?.2.3樣品處理將實驗用擬南芥樣品液氮速凍，然后用液氮預冷的研缽充分研磨，置于-70℃超低溫冰箱中備用。稱取250mg粉碎好的樣品于三角瓶中，加入4mL80%甲醇溶液(含0.3mmol/L銅試劑)，在-20℃放置過