固相萃取反相高效液相色譜熒光檢測法測定擬南芥中的生長素論文

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1、固相萃取反相高效液相色譜熒光檢測法測定擬南芥中的生長素論文符繼紅褚金芳王吉德閆存玉【摘要】建立了固相萃取反相高效液相色譜熒光檢測法測定擬南芥中生長素的方法。采用S)和液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(LCMS)技術。但是GCMS方法要求樣品的衍生化以提高揮發(fā)性和靈敏度，樣品處理過程復雜費時。LCMS/MS技術雖然有較高的靈敏度和選擇性，同位素內(nèi)標物的使用使其定量更為準確3～7。但由于儀器和內(nèi)標物的昂貴，限制了該方法的廣泛應用。高效液相色譜(HPLC)是一種通用的分析儀器，其在植物激素測定研究中已有報道，但因生物體內(nèi)激素的復雜性與特殊性，使其有效成分的提

2、取分離成為極為關鍵的一步。HPLC法測定多種植物內(nèi)源激素時經(jīng)常發(fā)生分離差、峰型不良及嚴重拖尾現(xiàn)象8，且樣品用量一般要求較多9,10，對一些特殊樣品無法實現(xiàn)測試要求。因此，選擇合適的植物激素提取方法和色譜條件尤為重要。本研究建立的固相萃取高效液相色譜(HPLC)熒光檢測法可以準確測定植物中的生長素類物質(zhì)，樣品用量少，可以滿足普通分析實驗室完成相關測試的要求。擬南芥(Arabidopsisthaliana)屬被子植物，雙子葉分綱，屬十字花科。因其具有生命周期短、自花授粉、核基因組小，結(jié)構簡單等優(yōu)點，是植物細胞遺傳學研究的經(jīng)典模式材料11。建立擬南芥

3、中植物激素生長素含量的測定方法對有關生長素作用機制及信號轉(zhuǎn)導途徑的研究具有重要意義。2實驗部分2.1儀器與試劑2695高效液相色譜儀(美國K2超純水儀(ELGA公司)制備的超純水;擬南芥(中科院遺傳與發(fā)育生物學研究所種植，生長期12d，長日照，16h光照，8h黑暗。溫度21～23℃，濕度50%～60%，光照強度80～120μmol/(s·m2)。2.2實驗方法2.2.1標準溶液的配制根據(jù)擬南芥中生長素含量范圍確定標樣濃度9。準確稱取0.05357g吲哚乙酸和0.06458g吲哚丙酸，用80%甲醇溶解并定容至25mL，配制成2.14g/L吲哚乙酸

4、和2.58g/L吲哚丙酸標準溶液。相應低濃度生長素標準液用80%甲醇稀釋而成。2.2.2色譜條件S是研究IAA使用最廣泛的分析儀器，但樣品處理要經(jīng)過繁瑣的純化和衍生過程13,14，處理過程中樣品損失量很大，不利于建立高通量的生長素測定方法。尋找一種快速、靈敏度高，成本低的方法，以期能在短時間內(nèi)處理多個樣品非常必要。與傳統(tǒng)的GCMS定量分析方法相比15,.freelolecularBiologyofPlants，Rockville，MD，AmericanSocietyofPlantBiologists，2000：8502YangShiJie(

5、楊世杰主編).PlantBiology(植物生物學).Beijing(北京)：SciencePress(科學出版社)，2000：2243MüllerA，DüchtingP，urchSJ，O′BrienR，SaxenaPK.J.Chromatogr.A，2006，1134：333～3376PanX，aZ，GeL，LeeASY，YongJodernMethodsofPlantAnalysis:Neany,1987：72～9113VineJH，NoitonD，PlummerJA，BaleriolaLucasC，MullinsMG.PlantPhys

6、iol.，1987，85：419～42214KambojJS，BrosSR，AmbroseSJ.PlantJ.，2003，35：405～41717BirkemeyerC，KolasaA，KopkaJ.J.Chromatogr.A，2003，993：89～102