頭孢拉定膠囊微生物限度檢查法的驗(yàn)證分析

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1、頭孢拉定膠囊微生物限度檢查法的驗(yàn)證分析【關(guān)鍵詞】微生物限度檢查；低速離心-薄膜過濾法；平皿法微生物限度檢查法系檢查非規(guī)定滅菌制劑及其原料、輔料受微生物污染程度的方法。檢查項(xiàng)目包括細(xì)菌數(shù)、霉菌數(shù)、酵母菌數(shù)及控制菌檢查［１］。我們采用常規(guī)方法對頭孢拉定膠囊進(jìn)行微生物限度檢查時發(fā)現(xiàn),不僅頭孢拉定本身對細(xì)菌的強(qiáng)抑制作用影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，而且頭孢拉定膠囊的某些輔料也對微生物限度檢查法產(chǎn)生一定影響，不能有效地保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。我們采用了低速離心-薄膜過濾法和平皿法相結(jié)合的實(shí)驗(yàn)方法來進(jìn)行頭孢拉定膠囊微生物限度檢查，取得了比較理想的實(shí)驗(yàn)效果。報告如下。1材料1.1培養(yǎng)基及試藥

2、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（批號：071008）、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基（批號：070329）、改良馬丁培養(yǎng)基（批號：061020）、改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基（批號：060404）、膽鹽乳糖培養(yǎng)基（批號：060913）、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（批號：061113）、MUG培養(yǎng)基（批號：060913）、分析純氯化鈉(批號：070725)試劑。81.2菌種大腸埃希菌［CMCC(B)44102］、金黃色葡萄球菌［CMCC(B)26003］、枯草芽孢桿菌［CMCC(B)63501］、白色念珠菌［CMCC(B)98001］、黑曲霉［CMCC(B)98003］，均由江蘇省藥檢所提供。1.3主要儀器設(shè)備

3、HHB11360型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）；DG2型多功能恒溫箱（上海醫(yī)療器械廠）；ZF7C型三用紫外分析儀（上?；埚慰茖W(xué)儀器有限公司）；YXQLS75SⅡ型全自動立式壓力蒸汽滅菌器（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；1013A鼓風(fēng)干燥箱（通州市滬通制藥機(jī)械設(shè)備廠）；HTY-2000A集菌儀（杭州泰林醫(yī)療器械廠）；800型離心沉淀器（江蘇江陰科研器械廠）。1.4樣品頭孢拉定膠囊，規(guī)格：0.25g，批號：071003，071113，071201。生產(chǎn)單位：江蘇聚榮制藥集團(tuán)有限公司。2方法82.1細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證［1］2.1

4、.1供試液制備取供試品10g，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液100ml，于45℃水浴中保溫、浸泡、振搖溶化，制成1∶10的供試液。2.1.2菌液的制備(1)將大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物1白金耳分別接種至10ml營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，30～35℃培養(yǎng)18～24h，分別取上述培養(yǎng)物1ml加入9ml0.9％的無菌氯化鈉溶液內(nèi)以10倍遞增稀釋制成每1ml含菌數(shù)50～100cfu的菌懸液。(2)將白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物1白金耳接種至10ml改良馬丁培養(yǎng)基中，23～28℃培養(yǎng)24～48h，取上述培養(yǎng)物1ml加入9ml0.9％的無菌氯化鈉溶液內(nèi)以

5、10倍遞增稀釋制成每ml含菌數(shù)50～100cfu的菌懸液。(3)將黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物接種至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基上，23～28℃培養(yǎng)5～7d，使大量孢子產(chǎn)生。加入0.9％無菌氯化鈉溶液5ml,用無菌玻棒輕輕將孢子洗脫，然后用一支管口包有無菌棉花且能過濾菌絲的10ml吸管吸出孢子液至無菌試管內(nèi)，用0.9％的無菌氯化鈉溶液稀釋再與標(biāo)準(zhǔn)比濁管比濁，其濁度與標(biāo)準(zhǔn)比濁管相當(dāng)后，再逐步稀釋制成每ml含孢子數(shù)50～100cfu的孢子懸液。2.1.3驗(yàn)證方法8本品對細(xì)菌生長有強(qiáng)抑制作用，藥典所規(guī)定的三株驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)用菌株：大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌對本品均較為敏感，

6、所以本品的細(xì)菌數(shù)測定應(yīng)采用薄膜過濾法。本品為膠囊劑，由于囊殼中的明膠使供試液在常溫下易成凝膠狀，而造成取樣困難，濾膜堵塞，所以應(yīng)注意操作全過程保持45℃。本制劑中含有一定量的不溶性輔料，宜采用低速離心-薄膜過濾聯(lián)合應(yīng)用。由于本品對真菌沒有抑制作用，進(jìn)行霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)無需采用薄膜過濾法，使用常規(guī)法（平皿法）即可使白色念珠菌和黑曲霉的回收率達(dá)到要求。2.1.3.1細(xì)菌計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證（低速離心-薄膜過濾聯(lián)合應(yīng)用）（1）供試液的制備。取1∶10的供試液10ml注入離心管中，500r/min，離心5min。取上清液置另一離心管中，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至

7、10ml。（2）試驗(yàn)組：用少量的稀釋劑將薄膜過濾器內(nèi)的濾膜濕潤。取低速離心后制備的供試液1ml加于pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液100ml中過濾，再用400mlpH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗濾膜，泵速為160轉(zhuǎn)，沖洗3次后將含50～100cfu／ml大腸埃希菌的菌懸液1ml加入剩余的100ml沖洗液中過濾。取出濾膜菌面朝上，貼于含2mlβ內(nèi)酰胺酶營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上，30～35℃培養(yǎng)48h。對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的驗(yàn)證同法操作。（3）菌液組：分別取上述稀釋的三株驗(yàn)證用菌的菌懸液各1ml，按照平皿菌落計(jì)數(shù)法測定其試驗(yàn)菌數(shù)。（4）供試品對照組

8、：按“2.1.3.1”（2）法（不加試