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1、防風通圣膠囊微生物限度檢查法驗證試驗蕪湖市食品藥品檢驗所1.樣品防風通圣膠囊(生產(chǎn)單位：蕪湖市中醫(yī)醫(yī)院、批號：080616)2.驗證用菌株大腸埃希菌［CMCC(B)44102］第2代、金黃色葡萄球菌［CMCC(B)26003］第2代、枯草芽抱桿菌［CMCC(B)63501］第2代、白色念珠菌［CMCC(F)98001］第2代、黑曲霉［CMCC(F)98003］第1代。以上菌種均購自中國藥品生物制品檢定所。3.方法屮國藥典2005年版微生物限度檢查方法驗證試驗。驗證試驗應進行3次獨立的平行試驗，并分別計算各試驗菌的回收率。4.具體操作方法4.1
2、.供試液制備：取防風通圣膠囊10g,加pH7.0無菌氯化鈉■蛋白H東緩沖液100ml,振搖溶解，作為410的供試液，再用上述稀釋液稀釋成1：102、1：103、1：104三個稀釋級，備用。4.2菌液制備(1)接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽抱桿菌的新鮮培養(yǎng)物至80ml營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18-24小時，用0.9%無菌氯化鈉溶液分別稀釋至10-5>10-5>10-6,制成lml含菌數(shù)為50-100cfu的菌懸液，做活菌計數(shù)備用。(2)接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至80ml改良馬丁培養(yǎng)基中，lOOrpm振蕩培養(yǎng)1&24小時，用0.9%無菌氯
3、化鈉溶液稀釋至10-6,制成lml含菌數(shù)為50-100cfu的菌懸液，做活菌計數(shù)備用。（3）取25°C培養(yǎng)5-7天的黑曲霉改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)物，加15ml0.9%無菌氯化鈉溶液洗下霉菌孑包子。吸取出1ml抱子懸液，然后用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋至10-6,制成每lml含菌數(shù)為50-100cfu的菌懸液，做活菌計數(shù)備用。4.3細菌、霉菌、酵母菌平皿法計數(shù)驗證（1）試驗組平皿法計數(shù)，分別取試驗用的1：103>1：104供試液lml和lml含50-100cfu試驗菌（大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽抱桿菌）的菌懸液，分別注入平皿中，立即傾注營
4、養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，35.8°C,48小時培養(yǎng)；分別取試驗用的10、1：102供試液lml和lml含50-100cfu試驗菌（白色念珠菌、黑曲霉）的菌懸液，分別注入平皿中，立即傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，25.5°C,72小時培養(yǎng)。每株試驗菌平行制備2個平1111,觀察并記錄菌落數(shù)，菌落計數(shù)見表1。表1試驗組菌落計數(shù)（cfu/ml）藥品批號大腸埃希菌金黃色葡萄球菌枯草芽泡桿菌白色念珠菌黑曲霉10?410-310-410-310-410-110-210-11010-2-308061699；10385；9184；8769；7163；6758；5977；84
5、65；7071；7663；7108061676；8364；6992；9584；8965；7057；6379；8171；7575；8175；7608061672；7568；7380；8575；7775；8169；7459；6560；6384；8581；87(2)菌液組平皿法計數(shù)，取lml含50-100cfu試驗菌(大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽鞄桿菌、白色念珠菌、黑曲霉)的菌懸液，分別注入平皿中，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基，其中大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽抱桿菌傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，35?8°C,48小時培養(yǎng)；白色念珠菌、黑曲霉傾注玫瑰紅鈉瓊脂
6、培養(yǎng)基，25?5°C,72小時培養(yǎng)。每株試驗菌平行制備2個平皿，測定所加試驗菌數(shù)，觀察并記錄菌落數(shù)，菌落計數(shù)見表2。表2菌液組菌落計數(shù)(cfu/ml)藥品批號大腸埃希菌金黃色葡萄球菌77；8395；9772；81枯草芽抱桿菌61；5862；6770；78白色念珠菌67；7375；8058；63黑曲霉73；8274；7783；8908061608061608061685；8976；8070；76(2)供試品對照組収規(guī)定量供試液測定供試品本底菌數(shù)，取1：103、1：104防風通圣膠囊供試液lml,加入平皿中，立即傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基,35.8°C培
7、養(yǎng)48小時；取1：10、1：102防風通圣膠囊供試液lml,加入平皿中，立即傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，25.5°C培養(yǎng)72小時，每個稀釋級供試液平行制備2個平皿，觀察并記錄結果。菌落計數(shù)見表3。表3供試品對照組菌落計數(shù)（cfu/ml）藥品批號大腸埃希菌金黃色葡萄球菌枯草芽范桿菌白色念珠菌黑曲霉10-410-310-410-310-410-110-210-11010■2-308061611；60；111；60；111；60；17；90；17；90；10806168；50；18；50；18；50；15；50；15；50；10806165；50；15
8、；50；15；50；17；10；17；10；1回收率計算：回收率二試驗組平均菌落數(shù)供試品對照組平均菌落數(shù)xlOO%菌液組平均菌落數(shù)試驗組菌的回收率見表4。表4試驗組
