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1、噬菌蛭弧菌的分離培養(yǎng)研究【關(guān)鍵詞】水蛭弧菌；弧菌，副溶性；雙層培養(yǎng)法；聚合酶鏈反應(yīng)蛭弧菌（Bdellovibro，簡(jiǎn)稱(chēng)BD）是革蘭陰性細(xì)菌，并可以通過(guò)裂解其寄生的革蘭陰性細(xì)菌維持自身的生長(zhǎng)發(fā)育[1]。目前，對(duì)蛭弧菌的研究主要集中在海水中，對(duì)淡水中的研究則很少。本實(shí)驗(yàn)利用普通蛋白胨培養(yǎng)基和營(yíng)養(yǎng)肉湯兩種培養(yǎng)基，采用描點(diǎn)法[2]、單層培養(yǎng)法[3]及雙層培養(yǎng)法[4]，對(duì)淡水環(huán)境中的噬菌蛭弧菌樣品進(jìn)行分離培養(yǎng)，以期找出最適合的培養(yǎng)方法及培養(yǎng)基?！ ?材料與方法 1.1原料 淡水樣品采自阿哈湖水庫(kù)，梯度稀釋至10-3倍。蛋白胨培養(yǎng)基（
2、Pp20）下層板(固體):1g蛋白胨,15g瓊脂,1L蒸餾水；Pp20上層板(半固體):1g蛋白胨,7g瓊脂,1L蒸餾水。營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基：蛋白胨5g，牛肉浸汁3g，蒸餾水1L稀釋500倍備用[4]。上層膠：NB×500培養(yǎng)液2ml，CaCl2·H2O3.94mg,MgCl2·6H2O203.3mg，瓊脂7g，加蒸餾水至1000ml，調(diào)節(jié)至pH8.0；下層膠：NB×500培養(yǎng)液2ml，CaCl2·H2O3.94mg,MgCl2·6H2O203.3mg，加蒸餾水至10005ml，瓊脂15g，調(diào)節(jié)至pH8.0。宿主菌：副溶血弧菌購(gòu)于
3、中國(guó)科學(xué)院菌種保藏中心。引物：正鏈CAGGCCTAACACATGCAAGTC，負(fù)鏈CGWCACTGAAGGGGCAA[5～7]。94℃,4min,94℃,1min,56℃,1min,72℃,1min,72℃,5min,4℃,∞?！ ?.2方法 描點(diǎn)法:將宿主菌分別涂布在蛋白胨培養(yǎng)基（固體）和營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（下層膠）上，用毛細(xì)吸管蘸一下樣品，點(diǎn)樣于在培養(yǎng)基不同位置。單層涂布法：將宿主與樣品混合，搖勻后直接涂布在蛋白胨培養(yǎng)基（固體）和營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（下層膠）上。雙層平板培養(yǎng)法：首先將蛋白胨培養(yǎng)基（固體）和營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（下層膠）
4、倒平板、凝固，將0.5ml宿主，5ml樣品和5ml上層膠充分混合，倒在下層膠上。3種方法點(diǎn)樣后30℃培養(yǎng)2～3d，觀察噬菌斑的生成并計(jì)數(shù)。3種培養(yǎng)方法各做3份，分別編號(hào)1、2、3?！ ?.3噬菌蛭弧菌的檢測(cè) 收取生成的噬菌斑，用16SrRNA基因特異性探針作引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)所得的細(xì)菌是否噬菌蛭弧菌?！ ?結(jié)果 2.1噬菌斑5 描點(diǎn)法點(diǎn)樣后培養(yǎng)2～3d，并無(wú)明顯的噬菌斑生成。單層涂布法培養(yǎng)2～3d后，在營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基上看到少數(shù)幾個(gè)小噬菌斑生成，噬菌斑形狀不規(guī)則（圖1）；而在蛋白胨培養(yǎng)基上未見(jiàn)噬菌斑的生成，雙層培養(yǎng)法
5、蛋白胨培養(yǎng)基上有明顯的、大塊的、圓形和不規(guī)則斑點(diǎn)（圖2），在營(yíng)養(yǎng)肉湯的雙層培養(yǎng)基上也可看到有圓形，透明的噬菌斑產(chǎn)生，數(shù)量較多（圖3,表1），但小于雙層蛋白胨培養(yǎng)基上的斑塊。表13種培養(yǎng)方法生成的噬菌斑數(shù)（略） 2.2PCR擴(kuò)增檢測(cè) 用16SrRNA基因特異性探針作引物來(lái)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)在蛋白胨培養(yǎng)及營(yíng)養(yǎng)肉湯單層涂布法所得的斑點(diǎn)中所提取的細(xì)菌不能得到擴(kuò)增條帶，而用營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)的噬菌斑中可以得到蛭弧菌（圖4）?！ ?討論實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，只有用營(yíng)養(yǎng)肉湯雙層培養(yǎng)后的活菌計(jì)數(shù)才能得到有效數(shù)字[8]。用描點(diǎn)法無(wú)法得到噬菌斑，這可能是
6、由于所取樣品量太少，蛭弧菌的濃度太低而無(wú)法形成明顯的噬菌斑。雙層培養(yǎng)法可以有效地分離出蛭弧菌，可能因?yàn)殡p層培養(yǎng)能給宿主和蛭弧菌一個(gè)更為穩(wěn)定的生長(zhǎng)環(huán)境，而且營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的效5果更好，可能由于培養(yǎng)基中牛肉浸汁和一些離子存在，不僅能使蛭弧菌得到培養(yǎng)，同時(shí)使宿主菌得到增長(zhǎng)，為蛭孤菌生長(zhǎng)提供優(yōu)質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境，故認(rèn)為營(yíng)養(yǎng)肉湯雙層培養(yǎng)是培養(yǎng)淡水蛭弧菌的最適方法?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 [1]WilliamsHN,FaklerWAJ,ShayDE.IncidenceofmarineBdellovibrioslyticagainstvibriopara
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