宮頸癌細(xì)胞fhit基因啟動(dòng)子cpg島甲基化狀態(tài)分析

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1、宮頸癌細(xì)胞FHIT基因啟動(dòng)子CpG島甲基化狀態(tài)分析【摘要】FHIT基因是一種與凋亡有關(guān)的腫瘤抑制基因，廣泛存在于各種細(xì)胞凋亡系統(tǒng)中，在多種腫瘤及細(xì)胞系中失活，其啟動(dòng)子部位CpG島甲基化是FHIT基因失活的主要機(jī)制之一。本研究應(yīng)用甲基化特異性PCR(MethylationspecificPCR，MSP)對(duì)不同宮頸鱗癌細(xì)胞系FHIT基因啟動(dòng)子CpG島甲基化狀態(tài)進(jìn)行檢測(cè)，在分子水平上了解FHIT異常甲基化與宮頸癌的相關(guān)性，為宮頸癌去甲基化治療提供依據(jù)?！娟P(guān)鍵詞】宮頸癌；FHIT基因；甲基化PCR　　DetectionofMethyl

2、ationoftheFHITPromoter5'CpGinHumanCervicalCancerCellLines　　Abstract：The5'CpGislandmethylationofFHITgenehasbeendetectedinmanycarcinomas，anditmaybearosesinactivationonFHITgene.Suchlittledetailsonmethylationstatusof5'CpGislandofFHITgeneincervicalcancercellwerereporte

3、d，sothisstudywasdesignedtoexploremethylationstatusof5'CpGislandofFHITgenein6cervicalcancercelllines.Wewanttorevealtherelationshipbetween6FHITgeneandtumourigensisand/ordevelopmentinhumancervicalcancer.　　Keywords：CervicalCancer；Fragilehistidinetriad(FHIT)gene；Methyla

4、tionspecificpolymerasechainreaction(MSP)　　國(guó)內(nèi)外有關(guān)宮頸癌與FHIT基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化的研究報(bào)道不多，結(jié)論尚不一致。Herman［1］等1996年建立的異常甲基化檢測(cè)方法(MSP)具有靈敏度高、特異性好、操作簡(jiǎn)便的特點(diǎn)。本研究擬應(yīng)用MSP技術(shù)分析人宮頸癌細(xì)胞株FHIT基因5'端CpG島甲基化水平，旨在揭示FHIT基因甲基化對(duì)人宮頸癌發(fā)生的影響，為尋找宮頸癌診斷和治療的新方法提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)?！　?材料與方法　　1．1材料SiHa、C41、Hela、RJC1、CS1213以及C3

5、3A細(xì)胞株為西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床分子生物學(xué)中心保存?！　?.2主要試劑RPMIMedium1640為美國(guó)GIBCO公司產(chǎn)品；熱啟動(dòng)Taq酶、HaeⅢdigestDNAMarker購(gòu)于日本Takara公司；亞硫酸氫鈉、氫鯤購(gòu)于美國(guó)Sigma公司。FHIT甲基化擴(kuò)增引物序列:F5_6TTGGGGCGCGGGTTTGGGTTTTTACGC3；R5_CGTAAACGACGCCGACCCCACTA3，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為74ｂｐ；非甲基化擴(kuò)增引物序列擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為F5_TTGGGGTGTGGGTTTGGGTTTTTATG3

6、；5_CATAAACAACACCAACCCCACTA3；兩組引物由上海生工生物公司合成?！　?.3方法　　1.3.1提取樣品常規(guī)細(xì)胞復(fù)蘇、傳代、收集細(xì)胞，-70℃保存。QiagenDNeasyTissuekit提取細(xì)胞基因組的DNA。取2μlDNA樣品加入98μlTE緩沖液稀釋，經(jīng)核酸蛋白分析儀測(cè)定260nm和280nm處的吸光度，若比值在1.8～2.0之間，說明樣品中的核酸較純。　　1.3.2亞硫酸氫鹽修飾雙蒸水稀釋2μgDNA至10μl，加入3mol/LNaOH1.1μl混勻；37℃水浴170min～20min；加入1

7、0mmol/L氫鯤6μl，輕輕搖勻；加入3.6mol/L亞硫酸氫鈉（pH5.0）104μl，輕輕混勻；至于PCR儀中，55℃溫浴18h(過夜)；置于-20℃保存。　　1.3.3PCR反應(yīng)及產(chǎn)物檢測(cè)94℃3min、94℃30s、65℃30s、72℃30s、40個(gè)循環(huán)、72℃延伸7min。取5μlPCR產(chǎn)物與1μl6LoadingBuffer混合，上2％瓊脂糖凝膠（0.5TBE），90V電泳206min，并以作為分子量參照標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行產(chǎn)物鑒定，凝膠成像分析系統(tǒng)分析并照相?！　?結(jié)果　　6個(gè)宮頸癌細(xì)胞株中，SiHa、C41、Hela、

8、C33A甲基特異性引物和非甲基特異性引物均擴(kuò)增擴(kuò)增出73bp的目的條帶，呈現(xiàn)出甲基化雜合性狀態(tài)，而RJC1、CS1213細(xì)胞僅甲基化引物擴(kuò)增出了目的條帶，非甲基化引物未擴(kuò)增出目的條帶，表現(xiàn)為完全甲基化狀態(tài)?！　?討論　　引起基因表達(dá)異常主要有遺傳學(xué)和表遺傳學(xué)兩種機(jī)制。后者可