宮頸癌細胞fhit基因啟動子cpg島甲基化狀態(tài)分

《宮頸癌細胞fhit基因啟動子cpg島甲基化狀態(tài)分》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內(nèi)容在工程資料-天天文庫。

1、宮頸癌細胞FHIT基因啟動子CpG島甲基化狀態(tài)分【摘要】FHIT基因是一種與凋亡有關的腫瘤抑制基因，廣泛存在于各種細胞凋亡系統(tǒng)中，在多種腫瘤及細胞系中失活，其啟動子部位CpG島甲基化是FHIT基因失活的主要機制之一。本研究應用甲基化特異性PCR(MethylationspecificPCR，MSP)對不同宮頸鱗癌細胞系FHIT基因啟動子CpG島甲基化狀態(tài)進行檢測，在分子水平上了解FHIT異常甲基化與宮頸癌的相關性，為宮頸癌去甲基化治療提供依據(jù)?！娟P鍵詞】宮頸癌；FHIT基因；甲基化PCR　　DetectionofMethylationoftheFHITPromoter5'C

2、pGinHumanCervicalCancerCellLines　　Abstract：The5'CpGislandmethylationofFHITgenehasbeendetectedinmanycarcinomas，anditmaybearosesinactivationonFHITgene.Suchlittledetailsonmethylationstatusof5'CpGislandofFHITgeneincervicalcancercellethylationstatusof5'CpGislandofFHITgenein6cervicalcancercelll

3、ines.SP)　　國內(nèi)外有關宮頸癌與FHIT基因啟動子區(qū)甲基化的研究報道不多，結(jié)論尚不一致。Herman［1］等1996年建立的異常甲基化檢測方法(MSP)具有靈敏度高、特異性好、操作簡便的特點。本研究擬應用MSP技術分析人宮頸癌細胞株FHIT基因5'端CpG島甲基化水平，旨在揭示FHIT基因甲基化對人宮頸癌發(fā)生的影響，為尋找宮頸癌診斷和治療的新方法提供理論和實驗依據(jù)?！　?材料與方法　　1．1材料SiHa、C41、Hela、RJC1、CS1213以及C33A細胞株為西安交通大學第一附屬醫(yī)院臨床分子生物學中心保存?！　?.2主要試劑RPMIMedium1640為美國GI

4、BCO公司產(chǎn)品；熱啟動Taq酶、HaeⅢdigestDNAMarker購于日本Takara公司；亞硫酸氫鈉、氫鯤購于美國Sigma公司。FHIT甲基化擴增引物序列:F5_TTGGGGCGCGGGTTTGGGTTTTTACGC3；R5_CGTAAACGACGCCGACCCCACTA3，擴增產(chǎn)物長度為74ｂｐ；非甲基化擴增引物序列擴增產(chǎn)物長度為F5_TTGGGGTGTGGGTTTGGGTTTTTATG3；5_CATAAACAACACCAACCCCACTA3；兩組引物由上海生工生物公司合成?！　?.3方法　　1.3.1提取樣品常規(guī)細胞復蘇、傳代、收集細胞，-70℃保

5、存。QiagenDNeasyTissuekit提取細胞基因組的DNA。取2μlDNA樣品加入98μlTE緩沖液稀釋，經(jīng)核酸蛋白分析儀測定260nm和280nm處的吸光度，若比值在1.8～2.0之間，說明樣品中的核酸較純?！　?.3.2亞硫酸氫鹽修飾雙蒸水稀釋2μgDNA至10μl，加入3mol/LNaOH1.1μl混勻；37℃水浴170min～20min；加入10mmol/L氫鯤6μl，輕輕搖勻；加入3.6mol/L亞硫酸氫鈉（pH5.0）104μl，輕輕混勻；至于PCR儀中，55℃溫浴18h(過夜)；置于-20℃保存?！　?.3.3PCR反應及產(chǎn)物檢測94℃3min、94℃

6、30s、65℃30s、72℃30s、40個循環(huán)、72℃延伸7min。取5μlPCR產(chǎn)物與1μl6LoadingBuffer混合，上2％瓊脂糖凝膠（0.5TBE），90V電泳20min，并以作為分子量參照標準進行產(chǎn)物鑒定，凝膠成像分析系統(tǒng)分析并照相?！　?結(jié)果　　6個宮頸癌細胞株中，SiHa、C41、Hela、C33A甲基特異性引物和非甲基特異性引物均擴增擴增出73bp的目的條帶，呈現(xiàn)出甲基化雜合性狀態(tài)，而RJC1、CS1213細胞僅甲基化引物擴增出了目的條帶，非甲基化引物未擴增出目的條帶，表現(xiàn)為完全甲基化狀態(tài)。　　3討論　　引起基因表達異常主要有遺傳學和表遺傳學兩種機制。

7、后者可以通過基因甲基化而發(fā)生，是指DNA的CpG島中胞嘧啶被甲基基團修飾，這是DNA在轉(zhuǎn)錄水平上的修飾方式之一。DNA甲基化改變不僅可以直接或間接影響基因轉(zhuǎn)錄，也可通過5甲基胞嘧啶脫氨基誘發(fā)胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)樾叵汆奏?，引起基因異常表達，還可引起染色體結(jié)構(gòu)改變，導致基因表達不穩(wěn)定。正常宮頸組織、癌前病變和宮頸癌組織FHIT基因DNA甲基化狀態(tài)并不相同［3］，表明DNA甲基化狀態(tài)可能直接與宮頸癌進展有關。本研究運用MSP法檢測宮頸癌細胞株FHIT基因甲基化狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)不同宮頸癌細胞株FHIT基因甲基化模式不完全相