反義寡核苷酸抑制人惡性黑素瘤a375細(xì)胞survivin mrna及其蛋白的表達(dá)

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1、反義寡核苷酸抑制人惡性黑素瘤A375細(xì)胞survivinmRNA及其蛋白的表達(dá)作者:梁秦龍,王梅,王冰,趙繼元【摘要】  目的研究survivin反義寡核苷酸(ASODN)對人惡性黑素瘤A375細(xì)胞survivinmRNA及蛋白表達(dá)的影響。方法人工合成survivinASODN,脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染人惡性黑素瘤細(xì)胞株A375,采用原位雜交、免疫組化SP法檢測survivinmRNA及其蛋白表達(dá)的變化。結(jié)果轉(zhuǎn)染24h后,ASODN組A375細(xì)胞survivinmRNA表達(dá)較對照組顯著下調(diào)(P<0.01);轉(zhuǎn)染48h后,與對照組相比,ASODN組細(xì)胞的survivin蛋白水平顯著下降(P<

2、;0.01)。結(jié)論SurvivinASODN可下調(diào)A375細(xì)胞survivinmRNA的表達(dá)和survivin蛋白水平?!娟P(guān)鍵詞】survivin惡性黑色素瘤反義寡核苷酸  ABSTRACT:ObjectiveTostudytheeffectsofsurvivinantisenseoligodexynucleotide(ASODN)ontheexpressionofsurvivinmRNAanditsproteininhumanmalignantmelanomacelllineA375.MethodsSurvivinASODNwassynthesizedandtransfectedinto

3、melanomacelllineA375bytheliposome-encapsulation.SurvivinmRNAandproteinweredetectedbyinsituhybridizationandimmunohistochemistry,respectively.9ResultsAt24hafterthetransfection,theexpressionofsurvivinmRNAwassignificantlylowerintheASODNgroupthaninthecontrolgroup(P<0.01).Theexpressionofsurvivinprote

4、inwasalsosignificantlydecreasedintheASODNgroupthaninthecontrolgroupat48haftertransfection(P<0.01).ConclusionSurvivinASODNcandown-regulatetheexpressionofsurvivinmRNAanditsproteininA375cells.  KEYWORDS:survivin;malignantmelanoma;antisenseoligonucleotide  Survivin是新近發(fā)現(xiàn)的一種結(jié)構(gòu)獨(dú)特的哺乳類凋亡抑制蛋白(inhibitiona

5、poptosisprotein,IAP),表達(dá)于人類大多數(shù)腫瘤組織,但是在正常成人組織不表達(dá)(胸腺除外)[1],與腫瘤發(fā)生、發(fā)展及治療抵抗密切相關(guān)。在惡性黑素瘤皮損[2]及其細(xì)胞株中[3]都存在survivin過表達(dá)。本研究以survivin反義寡核苷酸(antisenseoligonucleotide,ASODN)轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的惡性黑素瘤細(xì)胞株A375,分別用原位雜交和免疫組化的方法檢測人惡性黑素瘤細(xì)胞survivinmRNA表達(dá)及其蛋白水平的變化,初步探討反義寡核苷酸的作用機(jī)制,為survivinASODN治療惡性黑素瘤提供理論依據(jù)?! ?材料與方法9  1.1材料  人惡性黑素瘤細(xì)胞

6、株A375購于第四軍醫(yī)大學(xué)口腔生物學(xué)教研室;Oligofectamine轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen公司;Survivin原位雜交檢測試劑盒、DAB顯色試劑盒購自武漢博士德生物公司;羊抗人survivin多克隆抗體sc-8806購自SantaCruz公司;SP免疫組織化學(xué)試劑盒購自中山生物公司。  1.2全硫代寡核苷酸設(shè)計(jì)、合成和修飾  Survivin反義寡核苷酸序列設(shè)計(jì)參照文獻(xiàn)[4],由18個(gè)堿基組成,序列如下:5'-TGTGCTATTCTGTGAATT-3'。寡核苷酸的合成及全硫代磷酸化修飾均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。  1.3細(xì)胞培養(yǎng)  復(fù)蘇人源性惡性黑素瘤細(xì)胞株

7、A375,用含10mL/L胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng),2-3d傳代一次?! ?.4原位雜交測定survivinmRNA9  將無菌蓋玻片放入24孔培養(yǎng)板,以4×104/mL濃度接種細(xì)胞,6h后各孔分別置換為不含血清的、含ASODN的試驗(yàn)用培養(yǎng)液0.66mL。ASODN的處理濃度設(shè)為20μmol/L,脂質(zhì)體終濃度為1mL/L。實(shí)驗(yàn)分ASODN處理組和空白對照組:①ASODN處理組,即試驗(yàn)用培養(yǎng)液含20μmol/L

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