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《丙型肝炎病毒核心蛋白酵母雙雜交誘餌載體的構(gòu)建及人胎肝cdna文庫(kù)的擴(kuò)增、純化和鑒定》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫(kù)。
1、丙型肝炎病毒核心蛋白酵母雙雜交誘餌載體的構(gòu)建及人胎肝cDNA文庫(kù)的擴(kuò)增、純化和鑒定作者：劉敏，張偉，陳天艷，藺淑梅，趙良，劉錦鋒，趙英仁，張樹(shù)林【關(guān)鍵詞】丙型肝炎病毒核心蛋白摘要：目的用含丙型肝炎病毒核心(HCVcore)蛋白的cDNA片段構(gòu)建酵母雙雜交誘餌載體，并進(jìn)行人胎肝cDNA文庫(kù)的擴(kuò)增、純化和鑒定。方法PCR擴(kuò)增含HCVcore蛋白不同大小的cDNA片段，分別克隆入pUC19質(zhì)粒，經(jīng)測(cè)序正確后，再亞克隆入酵母雙雜交誘餌載體pGBKT7中。擴(kuò)增人胎肝cDNA文庫(kù)并純化、鑒定。結(jié)果獲得含HCVcore蛋白的cDNA片段，并成功克隆入pGBKT7中。待轉(zhuǎn)化的人肝cDNA文庫(kù)滴
2、度在5×108左右，純化后的質(zhì)粒DNA質(zhì)量濃度約1g/L。用EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切顯示插入片段大小不一。結(jié)論成功構(gòu)建了核心蛋白的酵母雙雜交誘餌載體；擴(kuò)增、純化的人胎肝cDNA文庫(kù)的多樣性很好，適合于篩選。為用酵母雙雜交技術(shù)研究與HCVcore蛋白相互作用的蛋白打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)?！ ￡P(guān)鍵詞：丙型肝炎病毒核心蛋白；酵母雙雜交；cDNA文庫(kù)12 ABSTRACT:ObjectiveToconstructthebaitvectorofHCVcoreregioninyeasttwohybridsystem,andtoamplify,purifyandevaluatethecDNAgen
3、ebankofhumanfetalliver.MethodsThecDNAfragmentsencodingHCVcoreregionwereamplifiedbyPCR,andthenwereclonedintopUC19.Afterbeingverifiedbysequencing,theyweresubclonedintothebaitvectorpGBKT7ofyeasttwohybridsystem,subsequentlyamplifiedandpurified.AndthenthecDNAgenebankofhumanfetalliverwasevaluated.
4、ResultsThecDNAfragmentsofHCVcoreregionwereamplifiedsuccessfully.ThecDNAgenebankofhumanfetalfetalliverwasabout5×108;thepurifiedDNAwasabout1g/L;andthebuiltinfragmentsweredifferentinsizeafterdigestedwithEcoRⅠandXhoⅠ.ConclusionThebaitvectorHCVcoreinyeasttwohybridsystem3isconstructedsuccessfully.
5、ThediversityofcDNAofhumanfetalliverafteramplifiedandpurifiedissuitableforscreening.TheselayarigidbasisforfurtherstudyoftheHCVcoreproteinandmayhelpusinunderstandinghowHCVworks. KEYWORDS:HCVcoreprotein;yeasttwohybridsystem;cDNAgenebank12 丙型肝炎病毒(HCV)感染是引起慢性肝炎、肝硬化和肝細(xì)胞癌的主要原因，全球超過(guò)1.7億人口血清HCV抗體陽(yáng)性
6、。目前對(duì)于HCV感染尚無(wú)有效的預(yù)防疫苗，病毒蛋白對(duì)HCV感染細(xì)胞的功能影響還很不明確，利巴韋林和干擾素聯(lián)合治療僅對(duì)部分病例有效。這就迫切要求我們進(jìn)一步了解病毒與細(xì)胞間的相互作用及免疫逃避機(jī)制。缺乏HCV感染和復(fù)制的組織培養(yǎng)系統(tǒng)、缺乏合適的HCV感染動(dòng)物模型是我們進(jìn)行HCV發(fā)病機(jī)制研究所面臨的主要障礙[1]。分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展為我們的研究提供了新的思路。 蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用是很多生命現(xiàn)象的基礎(chǔ)[2]。酵母雙雜交系統(tǒng)是近年來(lái)新發(fā)展起來(lái)的一種分析真核細(xì)胞中蛋白蛋白、蛋白DNA、蛋白R(shí)NA相互作用的一種有效的基因分析方法。酵母雙雜交Gal4系統(tǒng)3是在系統(tǒng)1和系統(tǒng)2基礎(chǔ)上的改進(jìn)
7、，具有轉(zhuǎn)化效率高，假陽(yáng)性率低等優(yōu)點(diǎn)，我們利用它來(lái)克隆與HCV核心(core)蛋白相互作用蛋白的基因，以期為HCVcore蛋白功能的研究提供新依據(jù)?！ ?材料與方法 1.1材料含HCV全長(zhǎng)cDNA質(zhì)粒pCDNA3.0HCV由第四軍醫(yī)大學(xué)微生物教研室尹文博士惠贈(zèng)；表達(dá)載體pGBKT7酵母菌種(美國(guó)Clontech公司)；質(zhì)粒pUC19菌種(本研究室保存)；PCR試劑盒、DNA重組所用的各種限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶(Gibco公司)；人肝酵母雙雜交cDNA文庫(kù)購(gòu)自Clontech公司。12
