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《丙型肝炎病毒核心蛋白酵母雙雜交誘餌載體的構(gòu)建及人胎肝cDNA文庫的擴(kuò)增、純化和鑒定【.doc》由會員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫。
1、臨床醫(yī)學(xué)論文?丙型肝炎病毒核心蛋白酵母雙雜交誘餌載體的構(gòu)建及人胎肝cDNA文庫的擴(kuò)增、純化和鑒定作者：劉敏，張偉，陳天艷，藺淑梅，趙良，劉錦鋒，趙英仁，張樹林【關(guān)鍵詞】丙型肝炎病毒核心蛋白摘要：目的用含丙型肝炎病毒核心(HCVcore)蛋白的cDNA片段構(gòu)建酵母雙雜交誘餌載體，并進(jìn)行人胎肝cDNA文庫的擴(kuò)增、純化和鑒定。方法PCR擴(kuò)增含HCVcore蛋白不同大小的cDNA片段，分別克隆入pUC19質(zhì)粒，經(jīng)測序正確后，再亞克隆入酵母雙雜交誘餌載體PGBKT7中。擴(kuò)增人胎肝cDNA文庫并純化、鑒定。結(jié)果獲得含HCVcore蛋白
2、的cDNA片段，并成功克隆入pGBKT7中。待轉(zhuǎn)化的人肝cDNA文庫滴度在5x108左右，純化后的質(zhì)粒DNA質(zhì)量濃度約lg/L。用EcoRI、XhoI雙酶切顯示插入片段大小不一。結(jié)論成功構(gòu)建了核心蛋白的酵母雙雜交誘餌載體；擴(kuò)增、純化的人胎肝cDNA文庫的多樣性很好，適合于篩選。為用酵母雙雜交技術(shù)硏究與HCVcore蛋白相互作用的蛋白打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：丙型肝炎病毒核心蛋白；酵母雙雜交；cDNA文庫ABSTRACT:ObjectiveToconstructthebaitvectorofHCVcoreregioninyeas
3、ttwohybridsystem,andtoamplify,purifyandevaluatethecDNAgenebankofhumanfetalliver?MethodsThecDNAfragmentsencodingHCVcoreregionwereamplificdbyPCR,andthenwereclonedintopUC19?Afterbeingverifiedbysequencing,theyweresubclonedintothebaitvectorpGBKT7ofyeasttwohybridsystem,
4、subsequentlyamplificdandpurified?AndthentheeDNAgenebankofhumanfetal1iverwasevaluated.ResultsThecDNAfragmentsofHCVcoreregionwereamplifiedsuccessfully.ThecDNAgenebankofhumanfetalfetalliverwasabout5xl08;thepurifiedDNAwasaboutlg/L;andthebui11infragmentsweredifferentin
5、sizeafterdigestedwithEcoRIandXhoI.ConclusionThebaitvectorHCVcoreinyeasttwohybridsystem3isconstructedsuccessfully.ThediversityofcDNAofhumanfetalliverafteramplifiedandpurifiedissuitableforscreening.TheselayarigidbasisforfurtherstudyoftheHCVcoreproteinandmayhelpusinu
6、nderstandinghowHCVworks?KEYWORDS:HCVcoreprotein;yeasttwohybridsystem;cDNAgenebank內(nèi)型肝炎病毒(HCV)感染是引起慢性肝炎、肝硬化和肝細(xì)胞癌的主要原因，全球超過1?7億人口血清HCV抗體陽性。目前對于HCV感染尙無有效的預(yù)防疫苗,病毒蛋白對HCV感染細(xì)胞的功能影響還很不明確，利巴韋林和干擾索聯(lián)合治療僅對部分病例有效。這就迫切要求我們進(jìn)一步了解病毒與細(xì)胞間的相互作用及免疫逃避機(jī)制。缺乏HCV感染和復(fù)制的組織培養(yǎng)系統(tǒng)、缺乏合適的HCV感染動物模型是
7、我們進(jìn)行HCV發(fā)病機(jī)制硏究所面臨的主要障礙［1］。分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展為我們的硏究提供了新的思路。蛋白質(zhì)勻蛋白質(zhì)的相互作用是很多生命現(xiàn)象的基礎(chǔ)［2］。酵母雙雜交系統(tǒng)是近年來新發(fā)展起來的一種分析真核細(xì)胞中蛋白蛋白、蛋白DNA、蛋白RNA相互作用的一種有效的基因分析方法。酵母雙雜交Gal4系統(tǒng)3是在系統(tǒng)1和系統(tǒng)2基礎(chǔ)上的改進(jìn)，具有轉(zhuǎn)化效率高，假陽性率低等優(yōu)點(diǎn)，我們利用它來克隆與HCV核心（core）蛋白相互作用蛋白的基因，以期為HCVcow蛋白功能的硏究提供新依據(jù)。1材料與方法1.1材料含HCV全長cDNA質(zhì)粒PCDNA3.0
8、HCV由第四軍醫(yī)大學(xué)微生物教硏室尹文博士恵贈；表迖載休pGBKT7酵母菌種（美國Ciontech公司）；質(zhì)粒pUC19菌種（本硏究室保存）；PCR試劑盒、DNA重組所用的各種限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶（Gibco公司）；人肝酵母雙雜交cDNA文庫購自Clontcch公司。1.2方法1.2.1PCR擴(kuò)
