基于直接標記法抗體微陣列的初步構(gòu)建

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1、基于直接標記法抗體微陣列的初步構(gòu)建作者：王麗梅，劉必成，呂林莉，鄭敏【摘要】目的：初步構(gòu)建基于直接標記法的抗體微陣列，并評價其應(yīng)用于臨床的可能性。方法：選擇白蛋白作為目標蛋白，通過瓊脂糖鋪片、玻片活化、機器點樣、點樣后固定等步驟構(gòu)建抗體微陣列，經(jīng)封閉非特異位點、標記抗原、加樣后對白蛋白進行檢測，對關(guān)鍵步驟——抗原標記進行最佳條件摸索，通過對臨床標本的檢測評價其潛在應(yīng)用價值。結(jié)果：應(yīng)用BCA蛋白定量試劑盒測定尿液樣本總蛋白濃度做出的標準曲線，其R2均大于0.99；溫度為37℃時抗原標記效果最佳；標記后

2、抗原存放1周對信號的影響無統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；本方法能夠檢測出臨床檢測為陰性的尿微量白蛋白濃度。結(jié)論:本研究構(gòu)建了基于直接標記法的抗體微陣列，并對關(guān)鍵的抗原標記環(huán)節(jié)進行了最佳工作條件優(yōu)化，有應(yīng)用于臨床檢測的潛力?！娟P(guān)鍵詞】抗體微陣列；直接標記法；BCA蛋白定量；蛋白標記抗體微陣列（antibodymicroarray,AbM）又稱抗體芯片，是一種特殊的蛋白質(zhì)芯片，芯片上固定抗體，通過特異性的免疫反應(yīng)捕獲待測樣品中的抗原，從而實現(xiàn)高通量的免疫檢測。AbM具有特異性和敏感性高（可達pg·ml-1

3、）、檢測范圍廣（5～250000pg·12ml-1）、高通量、平行性完成樣品的檢測等優(yōu)點。然而，要將其廣泛應(yīng)用于分析復雜樣本中低豐度蛋白仍有很多關(guān)鍵性技術(shù)亟需解決［12］?；谥苯訕擞浀腁bM，只需一個抗體即可實現(xiàn)靶蛋白的檢測，有別于基于雙抗體夾心免疫分析需要抗體對，容易實現(xiàn)多個目標因子檢測AbM的構(gòu)建。本研究旨在構(gòu)建基于瓊脂糖膜載體、直接標記免疫測定的AbM，通過孵育溫度、保存時間探討其關(guān)鍵步驟——抗原標記的最適反應(yīng)條件，為進一步的技術(shù)完善和未來臨床應(yīng)用做準備。1材料與方法1.1試劑與儀器人血清

4、白蛋白（humanserumalbumin，HSA）和NHS生物素購自德國Merck公司，單克隆的抗人血清白蛋白抗體購自英國Abcam公司，蛋白定量試劑盒和蛋白酶抑制劑購自美國Pierce公司，鏈酶親和素Cy3購自美國Zymed公司，小牛血清白蛋白（bovineseriumalbumin，BSA）和瓊脂糖購自美國Sigma公司，MilliQ超純水儀和超濾離心管購自美國Millipore公司；點樣儀PixSys5500arrayer購自美國PackardBioscience公司，激光共聚焦芯片掃

5、描儀LuxScanTM10K(A)及圖像分析軟件SpotDataPro2.0均購自北京博奧公司。1.2方法121.2.1載體的制備制備瓊脂糖膜玻片的過程如下：將未處理玻片浸入超純水中12h以上，然后在超聲清洗儀中以肥皂水清洗1h、超純水清洗1h，最終烘箱烘干玻片以備用。超純水配制0.5%的瓊脂糖溶液100ml，充分混勻后置微波爐煮沸至溶液透明；取1.5ml溶液均勻鋪至預(yù)熱的潔凈備用玻片上，室溫凝固后置37℃烤箱烘干備用。1.2.2載體的活化將備用瓊脂糖玻片置20mmol·L-1NaIO4溶液中，室

6、溫下?lián)u床慢搖活化30min，然后以0.01mmol·L-1pH7.4PBS洗滌5min×2次、超純水洗滌5min×1次,氮氣流吹干后即可進行下一步的點樣［3］。1.2.3點樣和固定抗HSA抗體經(jīng)點樣緩沖液（0.01mmol·L-1、pH7.4PBS溶液，甘油0.2L·L-1）按一定濃度梯度稀釋，通過一定順序置點樣板孔。按預(yù)設(shè)陣列進行機器點樣，點樣后玻片置濕盒4℃12固定。每張玻片陣列設(shè)計根據(jù)實驗需求而定，本實驗每張玻片點12個相同的亞陣列，每個亞陣列中有5個樣品，各樣品重復點樣4次。5個樣品依次為3

7、個倍比稀釋的抗HSA抗體（濃度依次為0.25、0.50、1.0mg·ml-1）、陰性控制（0.2mg·ml-1BSA）和陽性控制（一定濃度的鏈酶親和素Cy3），見圖1。1.2.4樣本收集和處理尿液樣本來源于東南大學附屬中大醫(yī)院內(nèi)分泌科住院病人（臨床診斷為糖尿病），留取標本時分兩份，1份送醫(yī)院臨床檢驗中心，1份留作實驗用。留取清晨中段尿，離心（3000r·min-1×10min）后取上清液，加入蛋白酶抑制劑和疊氮鈉（每1ml上清液中加入10μl蛋白酶抑制劑和2μl疊氮鈉），混勻后置-80℃冰箱保存以

8、備用。1.2.5蛋白質(zhì)標記樣本和白蛋白標準品均以NHS生物素進行標記，研究表明在AbM這一靈敏度很高的系統(tǒng)中生物素是復雜樣本標記的理想選擇［4］。首先，將保存于-80℃冰箱的尿液樣本置室溫下解凍，取適量應(yīng)用BCA蛋白定量試劑盒嚴格按照使用說明書上的操作流程對樣本中總蛋白的濃度進行測定；然后將樣本（或標準品白蛋白）和NHS生物素按照質(zhì)量比為2∶1進行混合，適當溫度下孵育一定時間，比較反應(yīng)溫度0、4、25和37℃對信號值的影響。將標記混合物移至超濾離心管（0.5ml,