基于直接標(biāo)記法抗體微陣列的初步構(gòu)建

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1、基于直接標(biāo)記法抗體微陣列的初步構(gòu)建：王麗梅，劉必成，呂林莉，鄭敏【摘要】目的：初步構(gòu)建基于直接標(biāo)記法的抗體微陣列，并評(píng)價(jià)其應(yīng)用于臨床的可能性。方法：選擇白蛋白作為目標(biāo)蛋白，通過(guò)瓊脂糖鋪片、玻片活化、機(jī)器點(diǎn)樣、點(diǎn)樣后固定等步驟構(gòu)建抗體微陣列，經(jīng)封閉非特異位點(diǎn)、標(biāo)記抗原、加樣后對(duì)白蛋白進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)關(guān)鍵步驟——抗原標(biāo)記進(jìn)行最佳條件摸索，通過(guò)對(duì)臨床標(biāo)本的檢測(cè)評(píng)價(jià)其潛在應(yīng)用價(jià)值。結(jié)果：應(yīng)用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定尿液樣本總蛋白濃度做出的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其R2均大于0.99；溫度為37℃時(shí)抗原標(biāo)記效果最佳；標(biāo)記后抗原存放1周對(duì)信號(hào)的影響無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；本方法能夠檢測(cè)出臨床檢測(cè)為陰

2、性的尿微量白蛋白濃度。結(jié)論:本研究構(gòu)建了基于直接標(biāo)記法的抗體微陣列，并對(duì)關(guān)鍵的抗原標(biāo)記環(huán)節(jié)進(jìn)行了最佳工作條件優(yōu)化，有應(yīng)用于臨床檢測(cè)的潛力?！娟P(guān)鍵詞】抗體微陣列；直接標(biāo)記法；BCA蛋白定量；蛋白標(biāo)記抗體微陣列（antibodymicroarray,AbM）又稱抗體芯片，是一種特殊的蛋白質(zhì)芯片，芯片上固定抗體，通過(guò)特異性的免疫反應(yīng)捕獲待測(cè)樣品中的抗原，從而實(shí)現(xiàn)高通量的免疫檢測(cè)。AbM具有特異性和敏感性高（可達(dá)pg·ml-1）、檢測(cè)范圍廣（5～250000pg·ml-1）、高通量、平行性完成樣品的檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)。然而，要將其廣泛應(yīng)用于分析復(fù)雜樣本中低豐度蛋白仍有很多關(guān)鍵性技術(shù)亟需解決［

3、12］。基于直接標(biāo)記的AbM，只需一個(gè)抗體即可實(shí)現(xiàn)靶蛋白的檢測(cè)，有別于基于雙抗體夾心免疫分析需要抗體對(duì)，容易實(shí)現(xiàn)多個(gè)目標(biāo)因子檢測(cè)AbM的構(gòu)建。本研究旨在構(gòu)建基于瓊脂糖膜載體、直接標(biāo)記免疫測(cè)定的AbM，通過(guò)孵育溫度、保存時(shí)間探討其關(guān)鍵步驟——抗原標(biāo)記的最適反應(yīng)條件，為進(jìn)一步的技術(shù)完善和未來(lái)臨床應(yīng)用做準(zhǔn)備。1材料與方法1.1試劑與儀器人血清白蛋白（humanserumalbumin，HSA）和NHS生物素購(gòu)自德國(guó)Merck公司，單克隆的抗人血清白蛋白抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，蛋白定量試劑盒和蛋白酶抑制劑購(gòu)自美國(guó)Pierce公司，鏈酶親和素Cy3購(gòu)自美國(guó)Zymed公司，小牛

4、血清白蛋白（bovineseriumalbumin，BSA）和瓊脂糖購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，MilliQ超純水儀和超濾離心管購(gòu)自美國(guó)Millipore公司；點(diǎn)樣儀PixSys5500arrayer購(gòu)自美國(guó)PackardBioscience公司，激光共聚焦芯片掃描儀LuxScanTM10K(A)及圖像分析軟件SpotDataPro2.0均購(gòu)自北京博奧公司。1.2方法1.2.1載體的制備制備瓊脂糖膜玻片的過(guò)程如下：將未處理玻片浸入超純水中12h以上，然后在超聲清洗儀中以肥皂水清洗1h、超純水清洗1h，最終烘箱烘干玻片以備用。超純水配制0.5%的瓊脂糖溶液100ml，充分混勻后

5、置微波爐煮沸至溶液透明；取1.5ml溶液均勻鋪至預(yù)熱的潔凈備用玻片上，室溫凝固后置37℃烤箱烘干備用。1.2.2載體的活化將備用瓊脂糖玻片置20mmol·L-1NaIO4溶液中，室溫下?lián)u床慢搖活化30min，然后以0.01mmol·L-1pH7.4PBS洗滌5min×2次、超純水洗滌5min×1次,氮?dú)饬鞔蹈珊蠹纯蛇M(jìn)行下一步的點(diǎn)樣［3］。1.2.3點(diǎn)樣和固定抗HSA抗體經(jīng)點(diǎn)樣緩沖液（0.01mmol·L-1、pH7.4PBS溶液，甘油0.2L·L-1）按一定濃度梯度稀釋，通過(guò)一定順序置點(diǎn)樣板孔。按預(yù)設(shè)陣列進(jìn)行機(jī)器點(diǎn)樣，點(diǎn)樣后玻片置濕盒4℃固定。每張玻片陣列設(shè)計(jì)根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求而定

6、，本實(shí)驗(yàn)每張玻片點(diǎn)12個(gè)相同的亞陣列，每個(gè)亞陣列中有5個(gè)樣品，各樣品重復(fù)點(diǎn)樣4次。5個(gè)樣品依次為3個(gè)倍比稀釋的抗HSA抗體（濃度依次為0.25、0.50、1.0mg·ml-1）、陰性控制（0.2mg·ml-1BSA）和陽(yáng)性控制（一定濃度的鏈酶親和素Cy3），見(jiàn)圖1。1.2.4樣本收集和處理尿液樣本于東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院內(nèi)分泌科住院病人（臨床診斷為糖尿?。?，留取標(biāo)本時(shí)分兩份，1份送醫(yī)院臨床檢驗(yàn)中心，1份留作實(shí)驗(yàn)用。留取清晨中段尿，離心（3000r·min-1×10min）后取上清液，加入蛋白酶抑制劑和疊氮鈉（每1ml上清液中加入10μl蛋白酶抑制劑和2μl疊氮鈉），混勻后置-

7、80℃冰箱保存以備用。1.2.5蛋白質(zhì)標(biāo)記樣本和白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品均以NHS生物素進(jìn)行標(biāo)記，研究表明在AbM這一靈敏度很高的系統(tǒng)中生物素是復(fù)雜樣本標(biāo)記的理想選擇［4］。首先，將保存于-80℃冰箱的尿液樣本置室溫下解凍，取適量應(yīng)用BCA蛋白定量試劑盒嚴(yán)格按照使用說(shuō)明書上的操作流程對(duì)樣本中總蛋白的濃度進(jìn)行測(cè)定；然后將樣本（或標(biāo)準(zhǔn)品白蛋白）和NHS生物素按照質(zhì)量比為2∶1進(jìn)行混合，適當(dāng)溫度下孵育一定時(shí)間，比較反應(yīng)溫度0、4、25和37℃對(duì)信號(hào)值的影響。將標(biāo)記混合物移至超濾離心管（0.5ml,濾過(guò)膜截留相對(duì)分子質(zhì)