大黃、當歸多糖對巨噬細胞甘露糖受體作用的研究

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1、大黃、當歸多糖對巨噬細胞甘露糖受體作用的研究【摘要】的:探討當歸多糖（APS）、大黃多糖（RTP）與腹腔巨噬細胞（Mφ）甘露糖受體（MR）的結(jié)合特性及其對腹腔Mφ免疫功能的影響。方法:以異硫氰酸熒光素標記的甘露糖化牛血清白蛋白(ManFITCBSA)可特異性的與甘露糖受體相結(jié)合為模型,以甘露糖為陽性對照、半乳糖為陰性對照,通過競爭性抑制實驗,將APS、RTP分別與腹腔Mφ共同孵育60min后,用熒光顯微鏡和多功能酶標儀檢測腹腔Mφ攝取ManFITCBSA的情況;通過ELISA方法檢測APS、RTP刺激Mφ分泌TN

2、Fα及IL4的情況。結(jié)果:D甘露糖、APS、RTP均可抑制腹腔Mφ吞噬ManFITCBSA,而D半乳糖則沒有此作用;APS、RTP均可誘導腹腔Mφ分泌TNFα,且呈劑量依賴性,甘露糖可完全阻滯RTP誘導Mφ分泌TNFα,對APS誘導Mφ分泌TNFα只有部分對抗作用;兩種多糖對IL4的分泌沒有統(tǒng)計學意義;甘露糖不能誘導Mφ分泌TNFα與IL4。結(jié)論:RTP引起的Mφ分泌TNFα作用是通過甘露糖受體介導,而APS的作用不僅僅與甘露糖受體有關(guān)。兩種多糖與甘露糖受體的作用差異可能與其單糖組成密切相關(guān)?！?/p>

3、關(guān)鍵詞】巨噬細胞甘露糖受體大黃多糖當歸多糖腫瘤壞死因子白細胞介素410　　許多中藥多糖能夠刺激巨噬細胞（Macrophage,Mφ）釋放前炎癥因子或者某些細胞因子,推測其可能機制與Mφ膜上的模式識別受體（pathogenrecognition,PRR）結(jié)合引起細胞內(nèi)某些信號通路的活化有關(guān)。前期研究發(fā)現(xiàn),當歸多糖（AngelicasinensisDielpolysaccharide,APS）能夠促進樹突狀細胞的成熟,增強抗原提呈能力［1,2］;促進脾細胞IL2、IFNγ的分泌［3］;而RTP（Rheumtanguti

4、cumpolysaccharide,RTP）能夠?qū)菇Y(jié)腸炎大鼠CD4+T細胞的擴增,降低克隆氏病大鼠IFNγ的升高,升高結(jié)腸炎小鼠降低的IL4水平［4,5］。但是RTP和APS的免疫反應作用機制,尚不清楚。　　Mφ是體內(nèi)特定的吞噬細胞和抗原提呈細胞,是連接先天免疫系統(tǒng)及后天免疫系統(tǒng)的橋梁。其表面眾多膜受體參與完成這些功能,Mφ甘露糖受體(MacrophageMannosereceptor,MMR)為其中之一。研究表明,MR是一種PRR,可特異性地識別以甘露糖、N乙酰葡糖胺或巖藻糖為末端的配體并與之結(jié)合［6］,這些配

5、體可來源于內(nèi)源性或外源性分子。推測MR在病原體的識別、吞噬與清除,在結(jié)核、腫瘤、感染等許多疾病過程中都發(fā)揮著重要的作用。我們的研究表明,RTP含有近50%的甘露糖［7］,組分RTP1,RTP2所含單糖比例不同;APS則含有N乙酰葡糖胺殘基［1］,組分APS1,APS2,APS103所含單糖比例也不同。這兩種多糖的免疫調(diào)節(jié)作用可能是通過MMR而起效的。本研究將探討APS混合組分、RTP混合組分對Mφ吞噬及分泌細胞因子的影響,以揭示兩種中藥多糖的免疫調(diào)節(jié)作用?！　?材料和方法　　1.1材料　　SD大鼠（200～2

6、20g,雌雄各半）,由第四軍醫(yī)大學動物實驗中心提供,動物分籠飼養(yǎng)于空調(diào)溫室內(nèi),溫度22±2℃,相對濕度50%～60%,自動調(diào)控晝夜各12h,顆粒飼料喂養(yǎng),自由飲水。RPMI1640培養(yǎng)基購自Gibco公司,胎牛血清購自杭州四季青公司生物制品廠,PBS緩沖液購自博士德生物工程公司,甘露糖購自上海試劑二廠;半乳糖購自國藥集團化學試劑有限公司;APS及RTP由我實驗室提供,EDTA以及異硫氰酸熒光素標記的甘露糖化牛血清白蛋白(ManFITCBSA)購自Sigma公司;GENiospro多功能酶標儀為瑞士TENCN公司產(chǎn)品;

7、NikonH600L熒光顯微鏡為日本Nikon公司產(chǎn)品?！　?.2方法　　1.2.1腹腔Mφ的分離、純化及培養(yǎng)　　取6只雌性SD大鼠,乙醚麻醉,750mL/L乙醇浸泡1min,10取出,消毒腹部皮膚,打開腹壁,但勿傷及腹膜。用注射器向腹腔內(nèi)注入PBS10mL,輕揉腹腔5min,剪開腹膜,用吸管吸取腹腔內(nèi)液體,注入離心管,1000r/min離心5min。棄上清,分別加入6mL含100mL/L胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液,吹打混勻后計數(shù),調(diào)整細胞密度為1×109個/L,分別接種腹腔Mφ于對應的培養(yǎng)板中,置37℃50mL/

8、LCO2孵箱中培養(yǎng)。3h后輕輕吸棄培養(yǎng)液后,再用PBS洗去未貼壁細胞,重復3次,每孔加入含100mL/L胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液,用姬姆薩瑞氏染色法染色,觀察Mφ占95％以上［8］。純化后的單層大鼠腹腔Mφ用含100mL/L小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液置于37℃50mL/LCO2孵箱中培養(yǎng)?！　?.2.