單克隆抗體的制備

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1、單克隆抗體的制備一、單克隆抗體技術(shù)的原理B淋巴細(xì)胞在抗原的刺激下，能夠分化、增殖形成具有針對(duì)這種抗原分泌特異性抗體的能力。B細(xì)胞的這種能力和量是有限的，不可能持續(xù)分化增殖下去，因此產(chǎn)生免疫球蛋白的能力也是極其微小的。將這種B細(xì)胞與非分泌型的骨髓瘤細(xì)胞融合形成雜交瘤細(xì)胞，再進(jìn)一步克隆化，這種克隆化的雜交瘤細(xì)胞是既具有瘤的無(wú)限生長(zhǎng)的能力，又具有產(chǎn)生特異性抗體的B淋巴細(xì)胞的能力，將這種克隆化的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)或注入小鼠體內(nèi)即可獲得大量的高效價(jià)、單一的特異性抗體。這種技術(shù)即稱為單克隆抗體技術(shù)。制備單克隆抗體的方法是用缺乏次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)化酶或胸腺嘧啶核苷酸酶

2、的瘤細(xì)胞變異株與脾臟的B細(xì)胞融合。采用HAT選擇性培養(yǎng)基（培養(yǎng)基中加次黃嘌呤HyPoxanthineH，氨基喋呤AminoopterinA及胸腺嘧啶核苷ThymidineT），在這種選擇性培養(yǎng)基中，由于變異的瘤細(xì)胞不具有次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)化酶或胸腺嘧啶核苷激酶，所以不能利用培養(yǎng)基中的次黃嘌呤或胸腺嘧啶核苷而合成DNA。而只能利用谷酰胺與尿核苷酸單磷酸合成DNA，這一途徑又被氨基喋呤所阻斷，所以未融合的瘤細(xì)胞不可避免也要死亡。融合的雜交瘤細(xì)胞由于脾淋巴細(xì)胞具有次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)化酶，可以通過(guò)次黃嘌呤合成DNA，克服氨基喋呤的阻斷，因此雜交瘤細(xì)胞大量繁殖而被

3、篩選出來(lái)。B淋巴細(xì)胞在一般培養(yǎng)基中不能長(zhǎng)期生長(zhǎng)，一般于二周內(nèi)均死亡。單克隆抗體與常規(guī)抗體相比有如下優(yōu)點(diǎn)：①單一特異性，與一個(gè)抗原決定簇反應(yīng)；②可重復(fù)性，能夠提供完全一樣的抗體制劑；③一經(jīng)制出，可無(wú)限量地供應(yīng)；④生產(chǎn)單克隆抗體，不一定需要純的抗原；⑤能查出混合物中存在的用常規(guī)方法查不出的少量成分。單克隆抗體與常規(guī)的血清抗體的性質(zhì)比較,見下表:性質(zhì)常規(guī)血清抗體單克隆抗體抗體含量少μg/ml多mg/ml無(wú)關(guān)的Ig多少或幾乎無(wú)其它血清蛋白有少，培養(yǎng)物上清常有10％胎牛血清Ag-Ab結(jié)合免疫原的全部成分的全部抗原決定簇免疫原中的一種成分的一個(gè)抗原決定簇特異性親和力

4、的重復(fù)性不同批號(hào)間有變化無(wú)變化與其它抗原的交叉反應(yīng)與帶有共同抗原決定簇的抗原有部分交叉一般無(wú)。結(jié)合到共同決定簇則是完全的免疫球蛋白的種類與亞類完全是混合的只是一種或幾種免疫球蛋白的物理性質(zhì)典型光譜抗體的單一性質(zhì)在開展雜交瘤細(xì)胞技術(shù)制備單抗之前，培養(yǎng)骨髓瘤和雜交瘤細(xì)胞必須具備下列設(shè)備：主要儀器：超凈工作臺(tái)、CO2恒溫培養(yǎng)箱、超低溫冰箱（-70℃）、倒置顯微鏡、精密天平或電子天平、液氮罐、離心機(jī)（水平轉(zhuǎn)子，4000r/min）、37℃水浴箱、純水裝置、濾器、真空泵等。主要器械：100ml、50ml、25ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶，10ml、1ml刻度吸管，試管，滴管（彎

5、頭、直頭），平皿，燒杯，500ml、250ml、100ml鹽水瓶，青霉素小瓶，10ml、5ml、1ml注射器等，96孔、24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，融合管（50ml圓底帶蓋玻璃或塑料離心管），眼科剪刀，眼科鑷，血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，可調(diào)微量加樣器（~50ul，~200ul，~1000ul），彎頭針頭，200目篩網(wǎng)，小鼠固定裝置等。雜交瘤細(xì)胞的篩選與檢測(cè)的儀器設(shè)備等。一、制備單克隆抗體的基本技術(shù)流程1、抗原制備從純度上說(shuō)雖不要求很高，但高純度的抗原使得到所需單抗的機(jī)會(huì)增加，同時(shí)可以減輕篩選的工作量。因此，免疫抗原是越純?cè)胶?，?yīng)根據(jù)所研究的抗原和實(shí)驗(yàn)室的條件來(lái)決定。一般來(lái)說(shuō)，

6、抗原的來(lái)源有限，或性質(zhì)不穩(wěn)定，提純時(shí)易變性，或其免疫原性很強(qiáng)，或所需單抗是用于抗原不同組分的純化或分析等，免疫用的抗原只需初步提純甚至不提純，但抗原中混雜物很多，特別是如果這些混雜物的免疫原性較強(qiáng)時(shí)，則必須對(duì)抗原進(jìn)行純化。檢測(cè)用抗原可以是與免疫抗原純度相同，也可是不同的純度，這主要決定于所用篩檢方法的種類及其特異性和敏感性。2、動(dòng)物免疫免疫動(dòng)物的選擇根據(jù)所用的骨髓瘤細(xì)胞可選用小鼠和大鼠作為免疫動(dòng)物。因?yàn)?，所有的供雜交瘤技術(shù)用的小鼠骨髓瘤細(xì)胞系均來(lái)源于BALB/c小鼠，所有的大鼠骨髓瘤細(xì)胞都來(lái)源于LOU/c大鼠，所以一般的雜交瘤生產(chǎn)都是用這兩種純系動(dòng)物作為

7、免疫動(dòng)物。但是，有時(shí)為了特殊目的而需進(jìn)行種間雜交，則可免疫其他動(dòng)物。Balb/c系小白鼠必須用純系的，雌雄均可，以8~12周齡為宜。免疫程序的確定一般而言，抗原的純度不很重要，特別是免疫原性較強(qiáng)的抗原。免疫程序、劑量和方法是關(guān)系到是否能得到所需要的單克隆抗體的關(guān)鍵之一。正常小鼠脾臟含有能產(chǎn)生各種不同抗體的B淋巴細(xì)胞，一只純種小白鼠估計(jì)能產(chǎn)生1.0×107~5.0×107種不同的抗體。因此一只正常的小白鼠的脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤融合，只能有千萬(wàn)分之一的機(jī)會(huì)獲得某一種特定抗體。所以為了提高得到某種雜交瘤的機(jī)會(huì)，必須加強(qiáng)免疫，使產(chǎn)生特異性抗體的B淋巴細(xì)胞大量增加。

8、B淋巴細(xì)胞的不同發(fā)育階段對(duì)獲得陽(yáng)性雜交瘤也有很大影響。有人認(rèn)為處在轉(zhuǎn)化時(shí)期的B淋