單克隆抗體的制備流程

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1、單克隆抗體的制備流程　　（一）動(dòng)物的選擇與免疫　　1．動(dòng)物的選擇　純種BALB/C小鼠，較溫順，離窩的活動(dòng)范圍小，體弱，食量及排污較小，一般環(huán)境潔凈的實(shí)驗(yàn)室均能飼養(yǎng)成活。目前開展雜交瘤技術(shù)的實(shí)驗(yàn)室多選用純種BALA/C小鼠。2．免疫方案　　選擇合適的免疫方案對(duì)于細(xì)胞融合雜交的成功，獲得高質(zhì)量的McAb至關(guān)重要。一般在融合前兩個(gè)月左右根據(jù)確立免疫方案開始初次免疫，免疫方案應(yīng)根據(jù)抗原的特性不同而定。（1）可溶性抗原免疫原性較弱，一般要加佐劑，半抗原應(yīng)先制備免疫原，再加佐劑。常用佐劑：福氏完全佐劑、福氏不完全佐劑。初次免

2、疫抗原1～50μg加福氏完全佐劑皮下多點(diǎn)注射或脾內(nèi)注射（一般0.8～1ml,0.2ml/點(diǎn)）↓3周后第二次免疫劑量同上，加福氏不完全佐劑皮下或ip（腹腔內(nèi)注射）（ip劑量不宜超過(guò)0.5ml）↓3周后第三次免疫劑量同一，不加佐劑，ip（5～7天后采血測(cè)其效價(jià)）↓2～3周加強(qiáng)免疫，劑量50～500μg為宜，ip或iv（靜脈內(nèi)注射）↓3天后取脾融合目前，用于可溶性抗原（特別是一些弱抗原）的免疫方案也不斷有所更新，如：①將可溶性抗原顆?；蚬滔嗷?，一方面增強(qiáng)了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。②改變抗原注入的途徑

3、，基礎(chǔ)免疫可直接采用脾內(nèi)注射。③使用細(xì)胞因子作為佐劑，提高機(jī)體的免疫應(yīng)答水平，增強(qiáng)免疫細(xì)胞對(duì)抗原的反應(yīng)性。（2）顆粒抗原免疫性強(qiáng)，不加佐劑就可獲得很好的免疫效果。以細(xì)胞性抗原為例，免疫時(shí)要求抗原量為1～2×107個(gè)細(xì)胞?！　〕醮蚊庖?×107/0.5mlip　　↓2～3周后　　第二次免疫1×107/0.5mlip　　↓3周后　　加強(qiáng)免疫（融合前三天）1×107/0.5mlip或iv　　↓　　取脾融合（二）細(xì)胞融合1．細(xì)胞融合前準(zhǔn)備（1）骨髓瘤細(xì)胞系的選擇：骨髓瘤細(xì)胞應(yīng)和免疫動(dòng)物屬于同一品系，這樣雜交融合率高，也便于

4、接種雜交瘤在同一品系小鼠腹腔內(nèi)產(chǎn)生大量McAb。（2）飼養(yǎng)細(xì)胞：在組織培養(yǎng)中，單個(gè)或少數(shù)分散的細(xì)胞不易生長(zhǎng)繁殖，若加入其它活細(xì)胞，則可促進(jìn)這些細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖，所加入的這種細(xì)胞數(shù)被稱為飼養(yǎng)細(xì)胞。在制備McAb的過(guò)程中，許多環(huán)節(jié)　需要加飼養(yǎng)細(xì)胞，如在雜交瘤細(xì)胞篩選、克隆化和擴(kuò)大培養(yǎng)過(guò)程中，加入飼養(yǎng)細(xì)胞是十分必要的。常用的飼養(yǎng)細(xì)胞有：小鼠腹腔巨噬細(xì)胞（較為常用）、小鼠脾臟細(xì)胞或胸腺細(xì)胞。也有人用小鼠成纖維細(xì)胞系3T3經(jīng)放射線照射后作為飼養(yǎng)細(xì)胞。飼養(yǎng)細(xì)胞的量為一般為2×104或105細(xì)胞/孔。2．細(xì)胞融合的步驟（1）制備飼養(yǎng)

5、細(xì)胞層：一般選用小鼠腹腔巨噬細(xì)胞。與免疫小鼠相同品系的小鼠，常用BALB/C小鼠，6～10周↓拉頸處死，浸泡在75%酒精內(nèi)，3～5min↓用無(wú)菌剪刀剪開皮膚，暴露腹膜↓用無(wú)菌注射器注入5～6ml預(yù)冷的培養(yǎng)液（嚴(yán)禁刺破腸管）↓反復(fù)沖洗，吸出沖洗液↓沖洗液放入10ml離心管，1200rpm/分離5～6min↓用20%小牛血清（NCS）或胎牛血清（FCS）的培養(yǎng)液混懸，調(diào)整細(xì)胞數(shù)至1×105/ml↓加入96孔板，100μl/孔↓放入37℃CO2孵箱培養(yǎng)（2）制備免疫脾細(xì)胞最后一次加強(qiáng)免疫3天后小鼠拉頸處死↓無(wú)菌取脾臟，培

6、養(yǎng)液洗一次↓脾臟研碎，過(guò)細(xì)胞篩↓離心，細(xì)胞用培養(yǎng)液洗2次↓計(jì)數(shù)↓取108脾淋巴細(xì)胞懸液備用（3）制備骨髓瘤細(xì)胞取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)骨髓瘤細(xì)胞離心↓用無(wú)血清培養(yǎng)液洗2次↓計(jì)數(shù)，取得×107細(xì)胞備用（4）融合①將骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞按1：10或1：5的比例混合在一起，在50ml離心管中用無(wú)血清不完全培養(yǎng)液洗1次，離心，1200rpm,8min;棄上清，用吸管吸凈殘留液體，以免影響聚乙二醇（PEG）濃度。輕輕彈擊離心管底，使細(xì)胞沉淀略松動(dòng)。②90s內(nèi)加入37℃預(yù)溫的1ml45%PEG（分子量4000）溶液，邊加邊輕微搖動(dòng)。37℃水浴

7、作用90s。③加37℃預(yù)溫的不完全培養(yǎng)液以終止PEG作用，每隔2min分別加入1ml、2ml、3ml、4ml、5ml和6ml。④離心，800rpm,6min。⑤充上清，用含20%小牛血清HAT選擇培養(yǎng)液重懸。⑥將上述細(xì)胞，加到已有飼養(yǎng)細(xì)胞層的96孔板內(nèi)，每孔加100μl。一般一個(gè)免疫脾臟可接種4塊96孔板。⑦將培養(yǎng)板置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。（三）選擇雜交瘤細(xì)胞及抗體檢測(cè)1．HAT選擇雜交瘤細(xì)胞　　　脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞經(jīng)PEG處理后，形成多種細(xì)胞的混合體，只有脾細(xì)胞與骨髓細(xì)胞形成的雜交瘤細(xì)胞才有意義。在HA

8、T選擇培養(yǎng)液中培養(yǎng)時(shí)，由于骨髓瘤細(xì)胞缺乏胸苷激酶或次黃嘌呤鳥嘌呤核糖轉(zhuǎn)移酶，故不能生長(zhǎng)繁殖，而雜交瘤細(xì)胞具有上述兩種酶，在HAT選擇培養(yǎng)液可以生長(zhǎng)繁殖。在用HAT選擇培養(yǎng)1～2天內(nèi)，將有大量瘤細(xì)胞死亡，3～4天后瘤細(xì)胞消失，雜交細(xì)胞形成小集落，HAT選擇培養(yǎng)液維持7～10天后應(yīng)換用HT培養(yǎng)液，再維持2周，改用一般培養(yǎng)液。在上述選擇培養(yǎng)期間，雜交瘤細(xì)胞布滿孔底