單克隆抗體的制備

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1、單克隆抗體的制備第一節(jié)雜交瘤技術的基本原理一、雜交瘤技術二、陽性雜交瘤細胞的克隆化培養(yǎng)與凍存第二節(jié)單克隆抗體的制備一、單克隆抗體的產生二、單克隆抗體的純化三、單克隆抗體的性質鑒定四、單克隆抗體的特性第三節(jié)基因工程抗體制備一、人源化抗體二、小分子抗體三、抗體融合蛋白四、雙特異性抗體五、噬菌體抗體庫技術第四節(jié)單克隆抗體的應用一、檢驗醫(yī)學診斷試劑二、蛋白質的提純三、小分子抗體的應用四、抗體融合蛋白的應用五、雙特異抗體的應用六、抗體庫技術的應用和前景思考題小結第一節(jié)雜交瘤技術的基本原理雜交瘤技術原理：聚乙二醇（PEG）：細胞融合劑，使免疫的小鼠脾細

2、胞與小鼠骨髓瘤細胞融合HAT培養(yǎng)基的選擇培養(yǎng)：反復的免疫學檢測篩選克隆化增殖的雜交瘤細胞系單克隆抗體生成：接種雜交瘤細胞于小鼠腹腔，腹水中即可得到高效價的單克隆抗體抗體種類：第一代抗體多克隆抗體（polyclonalantibody)第二代抗體單克隆抗體（monoclonalantibody)第三代抗體基因工程抗體（geneticengineeringantibody)B淋巴細胞:壽命短,分泌特異系性抗體骨髓瘤細胞：壽命長雜交瘤細胞：壽命長，單克隆抗體流程一、雜交瘤技術不產生Ig的重鏈和輕鏈HGPRT-;TK-與提供淋巴細胞的動物品系相同（

3、一）小鼠骨髓瘤細胞動物：BALB/c小鼠7～12周齡20g～25g體重（二）免疫脾細胞細胞性抗原：（1~2）×107/只，不加佐劑，2~3周重復一次可溶性抗原：首次，完全福氏佐劑+100微克抗原，3~6周100~200微克抗原，融合前3天，加強免疫免疫小鼠。淋巴細胞。淋巴細胞發(fā)育。漿細胞?？乖臃N培養(yǎng)液：RPM1640培養(yǎng)液DMEM培養(yǎng)液（三）細胞融合細胞融合劑：PEG:分子量4000的PEG是最常用的細胞融合劑作用機理：誘導細胞膜上脂類物質結構重排，使細胞膜易打開而有助于細胞融合作用特點：隨機發(fā)生的，不同廠商、批號、分子量的PEG，其純度

4、與毒性有所不同培養(yǎng)骨髓瘤細胞：選擇對數生長期的細胞進行傳代培養(yǎng)細胞形態(tài)：渾圓、透亮、均一、排列整齊避免細胞返祖：定期用8-AG處理細胞注意事項：切忌過多傳代培養(yǎng)，可將細胞分裝凍存于-80℃或液氮及干冰中免疫脾細胞的制備：1×108的淋巴細胞無菌手術飼養(yǎng)細胞：細胞密度過低不利于細胞生長繁殖常用小鼠腹腔細胞作飼養(yǎng)細胞其中MQ還有清除死亡細胞的作用飼養(yǎng)存活一般不超過2周，不影響雜交瘤細胞的純化。飼養(yǎng)細胞骨髓瘤細胞與淋巴細胞(1:3)50%PEG1min內加完;2min內加10ml培養(yǎng)液融合方法SP2/0細胞與脾細胞的比例為1：2～51ml50%的

5、PEG（無菌，預溫37℃）在1分鐘內滴完,靜置90秒,時間一到,將事先準備的培養(yǎng)液一滴一滴加入,停止PEG作用根據細胞數量加入HAT培養(yǎng)基，使之分加到96孔板中時每孔細胞數為（0.5～1.5）×105個。融合后7天，換用HT培養(yǎng)液細胞融合10～20天出現(xiàn)克隆HAT篩選挑克隆融合細胞的早期培養(yǎng)HGPRT酶與TK酶：次黃嘌呤磷酸核糖轉化酶胸腺嘧啶核苷激酶（四）雜交瘤細胞的選擇性培養(yǎng)應用液：8-雜氮鳥嘌呤聚乙二醇HAT培養(yǎng)基：H（Hypoxanthine）:次黃嘌呤A（Aminopterin）：氨基喋呤；葉酸拮抗物，阻斷DNA合成主要途徑T(Th

6、ymidine)：胸腺嘧啶核苷；“核苷酸前體”，供細胞通過替代途徑合成DNAHAT選擇作用：淋巴細胞：不能生長，5~7天死亡；DNA合成的主要途徑被A阻斷骨髓瘤細胞：不能生長，5~7天死亡；HGPRT缺乏，DNA合成的替代途徑受阻SP2/O:HGPRT-，TK-;長命脾細胞:HGPRT+，TK+;短命(7天)雜交瘤細胞:HGPRT+，TK+;長命骨髓瘤細胞、脾細胞與雜交瘤細胞雜交瘤細胞：長期生長繁殖利用淋巴細胞的HGPRT，將H合成為嘌呤堿并最終與T一起合成DNA從淋巴細胞獲得產生某種抗體的遺傳信息從骨髓瘤細胞獲得不斷繁殖的能力有限稀釋法(

7、limitingdilution)顯微操作法(micromanipulation)FACS法（fluorescenceactivatedcellsorter）軟瓊脂平板法(softagarmethod)二、陽性雜交瘤細胞的克隆化培養(yǎng)與凍存特點：不需任何特殊設備克隆出現(xiàn)效率高實驗室常用方法方法：細胞懸液通過系列稀釋每個培養(yǎng)孔含0.5～1個細胞有限稀釋法效率最高價格昂貴FACS配制方案：雜交瘤細胞（（1～5）x106/ml)+細胞凍存液(30%～40%牛血清，50%～60%RPMI-1640培養(yǎng)液，10%DMSO)“慢凍”：分步冷凍，30℃→-

8、70℃→液氮“快融”：取出立即浸入37℃～40℃水浴中，使其迅速融化、復蘇雜交瘤細胞的凍存與復蘇防止污染避免染色體丟失防止非分泌細胞的過度生長防止細胞密度過高而死亡細胞冷凍的意義