單克隆抗體的制備81013

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1、單克隆抗體的制備81013單克隆抗體的制備1975年Kohler和Milstein首先報(bào)道用細(xì)胞雜交技術(shù)使經(jīng)綿羊紅細(xì)胞（SRBC）免疫的小鼠脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合，建立起第一個(gè)Ｂ細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞株，并成功地制得抗SRBC的單克隆抗體（monoclonalantibody,McAb）。迄今全世界已研制成數(shù)以千的McAb。單克隆抗體的理化性狀高度均一，生物活性單一，與抗原結(jié)合的特異性強(qiáng)，便于人為處理和質(zhì)量控制，并且來源容易，所以一問世便受到歡迎和重視。在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中，McAb在診斷疾病、判斷預(yù)后、防治疾病以及疾病機(jī)制研究等方面起著巨大的促進(jìn)作用。為此，兩位發(fā)明者于1984年獲諾貝

2、??窖Ы薄?第一節(jié)雜交瘤技術(shù)的基本原理雜交瘤抗體技術(shù)的基本原理是通過融合兩種細(xì)胞而同時(shí)保持兩者的主要特征。這兩種細(xì)胞分別是經(jīng)抗原免疫的小鼠脾細(xì)胞和小鼠骨髓瘤細(xì)胞。脾淋巴細(xì)胞的主要特征是它的抗體分泌功能和能夠在選擇培養(yǎng)基中生長(zhǎng)（選擇原理見后），小鼠骨髓瘤細(xì)胞則可在培養(yǎng)條件下無限分裂、增殖，即??健壩郎?斃浴Ｔ諮≡衽嘌??淖饔孟攏?揮校孿赴?牘撬枇魷赴?諍系腦詠幌赴?啪哂諧中?鮒車哪芰Γ?緯賞?本弒縛固宸置詮δ芎捅３窒赴?郎?粵街痔卣韉南赴?寺?。其?澩酉鋁屑父鮒饕?街璨?鰲?（一）細(xì)胞的選擇與融合建立雜交瘤技術(shù)的目的是制備對(duì)抗原特異的單克隆抗體，所以融合細(xì)胞一方必須選擇經(jīng)過抗原

3、免疫的Ｂ細(xì)胞，通常來源于免疫動(dòng)物的脾細(xì)胞。脾是Ｂ細(xì)胞聚集的重要場(chǎng)所，無論以何種免疫方式刺激，脾內(nèi)皆會(huì)出現(xiàn)明顯的抗體應(yīng)答反應(yīng)。融合細(xì)胞的另一方則是為了保持細(xì)胞融合后細(xì)胞的不?顯鮒常?揮兄琢魷赴?啪弒剛庵痔匭?。选匝?惶逑檔南赴?稍黽尤諍系某曬β省６嚳⑿怨撬枇鍪牽孿赴?刀裥災(zāi)琢觶??允搶硐氳鈉⑾赴?諍習(xí)槁?。臍ぐ常用的\赴?鮒曖校?P3-X63-Ag8（KohlerandMilstein,1975）,P3-NSI/1-Ag4-1（KohlerandMilstein,1976），X63-Ag8.653（Kearneyetal,1979），Sp2/0-Ag14（Schulmaneta

4、l,1978）等，這些細(xì)胞株皆為HAT敏感細(xì)胞株。使用細(xì)胞融合劑造成細(xì)胞膜一定程度的損傷，使細(xì)胞易于相互粘連而融合在一起。最佳的融合效果應(yīng)是最低程度的細(xì)胞損傷而又產(chǎn)生最高頻率的融合。聚乙二醇（PEG1000～2000）是目前最常用的細(xì)胞融合劑，一般應(yīng)用濃度為40％（W/V）。（二）選擇培養(yǎng)基的應(yīng)用細(xì)胞融合是一個(gè)隨機(jī)的物理過程。在小鼠脾細(xì)胞和小鼠骨髓瘤細(xì)胞混合細(xì)胞懸液中，經(jīng)融合后細(xì)胞將以多種形式出現(xiàn)，如融合的脾細(xì)胞和瘤細(xì)胞、融合的脾細(xì)胞和脾細(xì)胞、融合的瘤細(xì)胞和瘤細(xì)胞、未融合的脾細(xì)胞、未融合的瘤細(xì)胞以及細(xì)胞的多聚體形式等。正常的脾細(xì)胞在培養(yǎng)基中存活??5～7天，無需特別篩選，細(xì)胞

5、的多聚體形式也容易死去。而未融合的瘤細(xì)胞則需進(jìn)行特別的篩選去除。細(xì)胞的DNA合成一般有兩條途徑。主途徑是由糖和氨基酸合成核苷酸，進(jìn)而合成DNA，葉酸作為重要的輔酶參與這一合成過程。另一輔助途徑是在次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷存在的情況下，經(jīng)次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)化酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK）的催化作用合成DNA。細(xì)胞融合的選擇?嘌??杏腥?種關(guān)鍵成份：次黃嘌呤（hypoxanthine,H）、氨甲喋呤（aminopterin,A）和胸腺嘧啶核苷（thymidine,T），所以取三者的字頭稱為HAT培養(yǎng)基。氨甲喋呤是葉酸的拮抗劑，可阻斷瘤細(xì)胞利用正常途徑合成DNA，而融合所

6、用的瘤細(xì)胞是經(jīng)毒性培養(yǎng)基選出的HGPRT-細(xì)胞株，所以不能在該培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。只有融合細(xì)胞具有親代雙方的遺傳性能，可在HAT培養(yǎng)基中長(zhǎng)期存活與繁殖（圖11-1）。par圖11-1細(xì)胞融合與HAT選擇示意圖（三）有限稀釋與抗原特異性選擇在動(dòng)物免疫中，應(yīng)選用高純度抗原。一種抗原往往有多個(gè)決定簇，一個(gè)動(dòng)物體在受到抗原刺激后產(chǎn)生的體液免疫應(yīng)答，實(shí)質(zhì)是眾多Ｂ細(xì)胞群的抗體分泌。而針對(duì)目標(biāo)抗原表位的Ｂ細(xì)胞只占極少部分。由于細(xì)胞融合是一個(gè)隨機(jī)的過程，在已經(jīng)融合的細(xì)胞中，有相當(dāng)比例的無關(guān)細(xì)胞的融合體??杈?稈∪コ?。篩選過程一般分兩步進(jìn)行：一是融合細(xì)胞的抗體篩選，二是在此基礎(chǔ)上進(jìn)行的特異性抗體

7、篩選。將融合的細(xì)胞進(jìn)行充分稀釋，使分配到培養(yǎng)板的每一孔中的細(xì)胞數(shù)在0至數(shù)個(gè)細(xì)胞之間（30%的孔為0才能保證每個(gè)孔中是單個(gè)細(xì)胞），培養(yǎng)后取上清以ELISA法選出抗體高分泌性細(xì)??徽庖還?程常被習(xí)慣地稱作克隆化。將這些陽性細(xì)胞再行克隆化，應(yīng)用特異性抗原包被的ELISA找出針對(duì)目標(biāo)抗原的抗體陽性細(xì)胞株，增殖后進(jìn)行凍存、體外培養(yǎng)或動(dòng)物腹腔接種培養(yǎng)。第二節(jié)制備單克隆抗體的基本技術(shù)制備單克隆抗體是復(fù)雜而費(fèi)時(shí)的工作，整個(gè)技術(shù)流程如圖11-2。┌─────┐│動(dòng)物免疫│└──┬──┘│──ELISA法測(cè)定抗血清┌───