實(shí)驗(yàn)十豬胰蛋白酶的純化及其活性測(cè)定

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1、實(shí)驗(yàn)十豬胰蛋白酶的純化及其活性測(cè)定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.學(xué)習(xí)胰蛋白酶的純化及其結(jié)晶的基本方法。2.學(xué)習(xí)用紫外法測(cè)定酶活性，搞清酶活性與比活性的概念。二、實(shí)驗(yàn)原理胰蛋白酶是以無(wú)活性的酶原形式存在于動(dòng)物胰臟中，在Ca2+的存在下，被腸激酶或有活性的胰蛋白酶自身激活，從肽鏈N端賴(lài)氨酸和異亮氨酸殘基之間的肽鍵斷開(kāi)，失去一段六肽，分子構(gòu)象發(fā)生一定改變后轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘囊鹊鞍酌?。胰蛋白酶原的分子量約為24000，其等電點(diǎn)約為pH8.9，胰蛋白酶的分子量與其酶原接近（23300），其等電點(diǎn)約為pH10.8，最適pH7.6～8.0，在pH=3時(shí)

2、最穩(wěn)定，低于此pH時(shí)，胰蛋白酶易變性，在pH>5時(shí)易自溶。Ca2+離子對(duì)胰蛋白酶有穩(wěn)定作用。重金屬離子，有機(jī)磷化合物和反應(yīng)物都能抑制胰蛋白酶的活性，胰臟、卵清和豆類(lèi)植物的種子中都存在著蛋白酶抑制劑。最近發(fā)現(xiàn)在一些植物的塊基（如土豆、白薯、芋頭等）中也存在有胰蛋白酶抑制劑。胰蛋白酶能催化蛋白質(zhì)的水解，對(duì)于由堿性氨基酸（精氨酸、賴(lài)氨酸）的羧基與其他氨基酸的氨基所形成的鍵具有高度的專(zhuān)一性。此外還能催化由堿性氨基酸和羧基形成的酰胺鍵或酯鍵，其高度專(zhuān)一性仍表現(xiàn)為對(duì)堿性氨基酸一端的選擇。胰蛋白酶對(duì)這些鍵的敏感性次序?yàn)椋乎ユI>酰胺鍵>

3、肽鍵。因此可利用含有這些鍵的酰胺或酯類(lèi)化合物作為底物來(lái)測(cè)定胰蛋白酶的活力。目前常用苯甲酰-L-精氨酸-對(duì)硝基苯胺（簡(jiǎn)稱(chēng)BAPA）和苯甲酰-L-精氨酸-β-萘酰胺（簡(jiǎn)稱(chēng)BANA）測(cè)定酰胺酶活力。用苯甲酰-L-精氨酸乙酯（簡(jiǎn)稱(chēng)BAEE）和對(duì)甲苯磺酰-L-精氨酸甲酯（簡(jiǎn)稱(chēng)TAME）測(cè)定酯酶活力。本實(shí)驗(yàn)以BAEE為底物，排毒養(yǎng)顏膠囊用紫外吸收法測(cè)定胰蛋白酶活力。酶活力單位的規(guī)定常因底物及測(cè)定方法而異。從動(dòng)物胰臟中提取胰蛋白酶時(shí)，一般是用稀酸溶液將胰腺細(xì)胞中含有的酶原提取出來(lái)，然后再根據(jù)等電點(diǎn)沉淀的原理，調(diào)節(jié)pH以沉淀除去大量的酸

4、性雜蛋白以及非蛋白雜質(zhì)，再以硫酸銨分級(jí)鹽析將胰蛋白酶原等（包括大量的酸性雜蛋白以及非蛋白雜質(zhì)，再以硫酸銨分級(jí)鹽析將胰蛋白酶原等（包括大量糜蛋白酶原和彈性蛋白酶原）沉淀析出。經(jīng)溶解后，以極少量活性胰蛋白酶激活，使其酶原轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘囊鹊鞍酌福拥鞍酌负蛷椥缘鞍酌竿瑫r(shí)也被激活），被激活的酶溶液再以鹽析分級(jí)的方法除去糜蛋白酶及彈性蛋白酶等組分。收集含胰蛋白酶的級(jí)分，并用結(jié)晶法進(jìn)一步分離純化。一般經(jīng)過(guò)2～3次結(jié)晶后，可獲得相當(dāng)純的胰蛋白酶，其比活力可達(dá)到8000～10000BAEE單位/毫克蛋白，或更高。如需制備更純的制劑，可用

5、上述酶溶液通過(guò)親和層析方法純化。三、器材與試劑（一）器材1.新鮮或冰凍豬胰臟2.食品加工機(jī)和高速分散器2463.研缽4.大玻璃漏斗5.小塑料桶6.布氏漏斗7.抽濾瓶8.紗布9.恒溫岳陽(yáng)家政水浴10.紫外分光光度計(jì)11.秒表12.pH試紙（二）試劑1.pH4～4.5乙酸酸化水2.2.5MH2SO43.5MNaOH4.硫酸銨5.氯化鈣6.2MNaOH7.0.8M，pH9.0硼酸緩沖液：取20ml0.8M硼酸溶液，加80ml0.2M四硼酸鈉溶液，混合后，用pH計(jì)檢查校正。8.0.4MpH9.0硼酸緩沖液（用“7”稀釋1倍即可）

6、9.0.2MpH8.0硼酸緩沖液：取70ml0.2M硼酸溶液，加30ml0.5M四硼酸鈉溶液，混合后，用pH計(jì)校正。10.2MHCl11.0.01MHCl12.BAEE－0.15MpH8.0Tris－HCl緩沖液（每毫升Tris緩沖液含0.11毫克BAEE和2.22毫克的氯化鈣）四、實(shí)驗(yàn)步驟1.豬胰蛋白酶結(jié)晶步驟豬胰臟1.0公斤（新鮮的或殺后立即冷藏的），除去脂肪和結(jié)締組織后，絞碎，加入2倍體積予冷的乙酸酸化水（pH4.0～4.5）于10～15℃攪拌提取24小時(shí)，四層紗布過(guò)濾得乳白色濾液，用2.5MH2SO4調(diào)pH至2.

7、5～3.0，放置3～4小時(shí)后用折迭濾紙過(guò)濾得黃色透明濾液（約1.5升），加入固體硫酸銨（予先研細(xì)），使溶液達(dá)0.75飽和度（每升濾液加492克）放置過(guò)夜后抽濾（擠壓干），濾餅分次加入10倍體積（按餅重計(jì)）冷的蒸餾水，使濾餅溶解，痔瘡偏方得胰蛋白酶原溶液，取樣0.5ml后進(jìn)行活化：慢慢加入研細(xì)的固體無(wú)水氯化鈣（濾餅中硫酸銨的含量按餅重的四分之一計(jì)）使Ca2+與SO42-結(jié)合后，溶液中仍含有0.1MCaCl2，邊加邊攪拌，用5MNaOH調(diào)pH至8.0，加入極少量豬胰蛋白酶輕輕攪拌，于室溫下活化8～10小時(shí)，（2～3小時(shí)取樣一

8、次，并用0.001MHCl稀釋?zhuān)?，測(cè)定酶活性增加的情況?；罨瓿桑ū然罴s3500～4000BAEE單位）后，用2.5MH2SO4調(diào)pH至2.5～3.0，抽濾除去CaSO4246沉淀，棄去濾餅，濾液取樣測(cè)定胰蛋白酶活性及蛋白質(zhì)含量，按242克/升加入細(xì)粉狀固體硫酸銨，使溶液達(dá)到0.4飽和度，放置數(shù)小時(shí)后，抽濾，棄去濾餅