聚己內(nèi)酯電紡纖維支架材料對骨髓基質(zhì)細(xì)胞增殖及分化的影響

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1、聚己內(nèi)酯電紡纖維支架材料對骨髓基質(zhì)細(xì)胞增殖及分化的影響【摘要】目的：觀察聚己內(nèi)酯（PCL）電紡纖維支架材料對骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSCs)增殖及分化特點的影響，評價其作為骨組織工程的支架材料的應(yīng)用前景.方法:將兔BMSCs與PCL電紡纖維支架材料在培養(yǎng)板內(nèi)共培養(yǎng).采用形態(tài)學(xué)觀察、MTT法及ALP檢測等方法檢測BMSCs在PCL電紡纖維表面的粘附、增殖和分化能力.結(jié)果:體外培養(yǎng)的BMSCs能在PCL電紡纖維表面正常粘附和增殖，并且表達(dá)較高的堿性磷酸酶活性.結(jié)論:PCL電紡纖維適合作為支架材料應(yīng)用于BMSCs為種子細(xì)胞的組織構(gòu)建.【關(guān)鍵詞

2、】電紡纖維;聚己內(nèi)酯;骨髓基質(zhì)細(xì)胞　　0引言　　理想的組織工程支架材料要求其不但能夠作為種子細(xì)胞體內(nèi)擴增和增殖的支架，而且應(yīng)當(dāng)能夠成為生長因子、生物活性物質(zhì)和基因的生物載體，發(fā)揮細(xì)胞功能調(diào)節(jié)的作用［1］.目前已有近百種聚合物成功的通過這一技術(shù)獲取了超細(xì)纖維并被陸續(xù)應(yīng)用于膜技術(shù)、增強材料、紡織品、光學(xué)傳感器、醫(yī)藥釋放體系以及組織工程支架材料制備等諸多領(lǐng)域［2］.本研究旨在通過聚己內(nèi)酯（polycaprolactone,PCL）電紡纖維支架材料對兔骨髓基質(zhì)細(xì)胞（bonemarrowstromalcells,BMSCs）生長、增殖和功能

3、分化作用的研究，初步探討PCL電紡纖維作為組織工程支架材料的應(yīng)用前景.　　1材料和方法　　1．1材料聚己內(nèi)酯（PCL，美國Sigma公司，Mn=80000）；二甲基甲酰胺（DMF，西安化學(xué)試劑公司）；氯仿（西安化學(xué)試劑公司）；BGG40/2高壓直流電源(北京機電研究所，030KV)；JSM6700F型掃描電鏡(日本JEOL公司)；BX60型熒光顯微鏡(日本Olympus公司)；酶聯(lián)免疫檢測儀（美國BioTek公司）；1.5mo齡新西蘭幼兔1只，雄性，體質(zhì)量1.5kg(第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心)；DMEM培養(yǎng)液（美國Gibco

4、BRL公司）；胎牛血清（浙江金華清湖犢牛利用研究所）；胰蛋白酶（上海浦東生化試劑廠）；MTT（美國Sigma公司）；PholloidinFITC（美國Sigma公司）；堿性磷酸酶(alkalinePhosphatase，ALP)檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）.　　1.2方法　　1.2.1PCL電紡纖維支架的制備以氯仿/DMF（體積比2∶1）的混合溶液為溶劑，配制濃度為80g/L的PCL電紡絲溶液.將電紡絲溶液加入一個安裝有8號不銹鋼注射針頭的自制玻璃加樣管.針頭即噴絲口與BGG40/2高壓直流電源的正極相連，針頭下方安裝一

5、個接地的銅板，上覆鋁箔作為纖維的接收屏與高壓直流電源的負(fù)極相連.在外加電壓10kV，接收距離12cm，電紡絲溶液流量為3mL/h的條件下進(jìn)行靜電紡絲.收集接收屏表面獲得的縱橫交錯的無紡纖維氈，置于干燥器中干燥保存.　　1.2.2兔BMSCs的原代培養(yǎng)與接種取新西蘭幼兔四肢長骨，縱行剖開，DMEM培養(yǎng)液沖洗骨髓腔，靜置后取上清進(jìn)行培養(yǎng)BMSCs.24h后換液，去除未貼壁的血細(xì)胞.每3d換液1次，2.5g/L胰酶常規(guī)消化傳代，倒置顯微鏡下觀察.取第二代生長良好的BMSCs，胰酶消化傳代.實驗分組為PCL電紡纖維實驗組和細(xì)胞培養(yǎng)板對照組

6、兩組.將傳代培養(yǎng)的第二代BMSCs以4×104/cm2濃度接種于各組，每孔加入500μL接種細(xì)胞液，置入細(xì)胞培養(yǎng)箱4h，再加入500μL培養(yǎng)液，50mL/LCO2,飽和濕度、37℃繼續(xù)培養(yǎng).　　1.2.3肌動蛋白actin直接免疫熒光染色培養(yǎng)8h后取出PCL電紡纖維試件，PBS沖洗3遍.37mL/L甲醛的PBS溶液固定5min,PBS洗滌2遍.丙酮脫水，1mL/LTritonX100滲透5min.10mg/LPholloidinFITC37℃孵育染色40min，抗熒光淬滅液封片.于365nm熒光顯微鏡下觀察記錄.　　1.2.4

7、掃描電鏡觀察于培養(yǎng)3d后取出PCL電紡纖維試件，PBS沖洗3遍，25mL/L戊二醛固定24h.乙腈梯度脫水，10g/L鋨酸處理1h，臨界點干燥，離子濺射儀噴金.導(dǎo)電膠固定，以冷場發(fā)射掃描電子顯微鏡觀察，電子加速率為5kV.　　1.2.5MTT檢測于培養(yǎng)1，3，5，7d后向?qū)嶒灨鹘M分別加入2.5g/L胰蛋白酶消化3min，然后加入含100mL/L胎牛血清的DMEM終止消化.500g離心10min，每管重新加入DMEM培養(yǎng)液200μL，接種至96孔培養(yǎng)板.每組4孔，每孔加入5g/L的MTT溶液20μL，37℃孵育4h.在酶聯(lián)免疫檢測儀

8、上測各孔A490nm值，每組3個試件.　　1.2.6ALP活性檢測培養(yǎng)的第3，7,14日后，向?qū)嶒灨鹘M分別加入2.5g/L胰蛋白酶消化3min，然后加入含100mL/L胎牛血清的DMEM終止消化.將每個樣本的細(xì)胞懸液加入離心管，500g離心10mi