談聚己內(nèi)酯電紡纖維支架材料對(duì)骨髓基質(zhì)細(xì)胞增殖及分化的影響

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1、談聚己內(nèi)酯電紡纖維支架材料對(duì)骨髓基質(zhì)細(xì)胞增殖及分化的影響【目的:觀察聚己內(nèi)酯(PCL)電紡纖維支架材料對(duì)骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSCs)增殖及分化特征的影響,評(píng)價(jià)其作為骨組織工程的支架材料的應(yīng)用遠(yuǎn)景.方法:將兔BMSCs和PCL電紡纖維支架材料在培養(yǎng)板內(nèi)共培養(yǎng).采用形態(tài)學(xué)觀察、MTT法及ALP檢測(cè)等方法檢測(cè)BMSCs在PCL電紡纖維表面的粘附、增殖和分化能力.結(jié)果:體外培養(yǎng)的BMSCs能在PCL電紡纖維表面正常粘附和增殖,并且表達(dá)較高的堿性磷酸酶活性.結(jié)論:PCL電紡纖維適合作為支架材料應(yīng)用于BMSCs為種子細(xì)胞的組織構(gòu)

2、建.【電紡纖維;聚己內(nèi)酯;骨髓基質(zhì)細(xì)胞  0引言  理想的組織工程支架材料要求其不但能夠作為種子細(xì)胞體內(nèi)擴(kuò)增和增殖的支架,而且應(yīng)當(dāng)能夠成為生長(zhǎng)因子、生物活性物質(zhì)和基因的生物載體,發(fā)揮細(xì)胞功能調(diào)節(jié)的功能[1].目前已有近百種聚合物成功的通過(guò)這一技術(shù)獲取了超細(xì)纖維并被陸續(xù)應(yīng)用于膜技術(shù)、增強(qiáng)材料、紡織品、光學(xué)傳感器、醫(yī)藥開(kāi)釋體系以及組織工程支架材料制備等諸多領(lǐng)域[2].本探究旨在通過(guò)聚己內(nèi)酯(polycaprolactone,PCL)電紡纖維支架材料對(duì)兔骨髓基質(zhì)細(xì)胞(bonemarroalcells,BMSCs)生長(zhǎng)、增

3、殖和功能分化功能的探究,初步探索PCL電紡纖維作為組織工程支架材料的應(yīng)用遠(yuǎn)景.  1材料和方法  1.1材料聚己內(nèi)酯(PCL,美國(guó)Sigma公司,Mn=80000);二甲基甲酰胺(DMF,西安化學(xué)試劑公司);氯仿(西安化學(xué)試劑公司);BGG40/2高壓直流電源(北京機(jī)電探究所,0?30KV);JSM?6700F型掃描電鏡(日本JEOL公司);BX60型熒光顯微鏡(日本Olympus公司);酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(美國(guó)Bio?Tek公司);1.5mo齡新西蘭幼兔1只,雄性,體質(zhì)量1.5kg(第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心);DME

4、M培養(yǎng)液(美國(guó)GibcoBRL公司);胎牛血清(浙江金華清湖犢牛利用探究所);胰蛋白酶(上海浦東生化試劑廠);MTT(美國(guó)Sigma公司);Pholloidin?FITC(美國(guó)Sigma公司);堿性磷酸酶(alkalinePhosphatase,ALP)檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程探究所).  1.2方法  1.2.1PCL電紡纖維支架的制備以氯仿/DMF(體積比2∶1)的混合溶液為溶劑,配制濃度為80g/L的PCL電紡絲溶液.將電紡絲溶液加進(jìn)一個(gè)安裝有8號(hào)不銹鋼注射針頭的自制玻璃加樣管.針頭即噴絲口和BGG40/

5、2高壓直流電源的正極相連,針頭下方安裝一個(gè)接地的銅板,上覆鋁箔作為纖維的接收屏和高壓直流電源的負(fù)極相連.在外加電壓10kV,接收間隔12cm,電紡絲溶液流量為3mL/h的條件下進(jìn)行靜電紡絲.收集接收屏表面獲得的縱橫交錯(cuò)的無(wú)紡纖維氈,置于干燥器中干燥保存.  1.2.2兔BMSCs的原代培養(yǎng)和接種取新西蘭幼兔四肢長(zhǎng)骨,縱行剖開(kāi),DMEM培養(yǎng)液沖洗骨髓腔,靜置后取上清進(jìn)行培養(yǎng)BMSCs.24h后換液,往除未貼壁的血細(xì)胞.每3d換液1次,2.5g/L胰酶常規(guī)消化傳代,顛倒顯微鏡下觀察.取第二代生長(zhǎng)良好的BMSCs,胰酶消

6、化傳代.實(shí)驗(yàn)分組為PCL電紡纖維實(shí)驗(yàn)組和細(xì)胞培養(yǎng)板對(duì)照組兩組.將傳代培養(yǎng)的第二代BMSCs以4×104/cm2濃度接種于各組,每孔加進(jìn)500μL接種細(xì)胞液,置進(jìn)細(xì)胞培養(yǎng)箱4h,再加進(jìn)500μL培養(yǎng)液,50mL/LCO2,飽和濕度、37℃繼續(xù)培養(yǎng).  1.2.3肌動(dòng)蛋白actin直接免疫熒光染色培養(yǎng)8h后取出PCL電紡纖維試件,PBS沖洗3遍.37mL/L甲醛的PBS溶液固定5min,PBS洗滌2遍.丙酮脫水,1mL/LTritonX?100滲透5min.10mg/LPholloidin?FITC37℃孵育染色40m

7、in,抗熒光淬滅液封片.于365nm熒光顯微鏡下觀察記錄.  1.2.4掃描電鏡觀察于培養(yǎng)3d后取出PCL電紡纖維試件,PBS沖洗3遍,25mL/L戊二醛固定24h.乙腈梯度脫水,10g/L鋨酸處理1h,臨界點(diǎn)干燥,離子濺射儀噴金.導(dǎo)電膠固定,以冷場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡觀察,電子加速率為5kV.  1.2.5MTT檢測(cè)于培養(yǎng)1,3,5,7d后向?qū)嶒?yàn)各組分別加進(jìn)2.5g/L胰蛋白酶消化3min,然后加進(jìn)含100mL/L胎牛血清的DMEM終止消化.500g離心10min,每管重新加進(jìn)DMEM培養(yǎng)液200μL,接種至96孔

8、培養(yǎng)板.每組4孔,每孔加進(jìn)5g/L的MTT溶液20μL,37℃孵育4h.在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)各孔A490nm值,每組3個(gè)試件.  1.2.6ALP活性檢測(cè)培養(yǎng)的第3,7,14日后,向?qū)嶒?yàn)各組分別加進(jìn)2.5g/L胰蛋白酶消化3min,然后加進(jìn)含100mL/L胎牛血清的DMEM終止消化.將每個(gè)樣本的細(xì)胞懸液加進(jìn)離心管,500g離心10min.每管加進(jìn)200μL細(xì)

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