聚己內酯電紡纖維支架材料對骨髓基質細胞增殖及分化的影響

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1、聚己內酯電紡纖維支架材料對骨髓基質細胞增殖及分化的影響【摘要】目的：觀察聚己內酯（PCL）電紡纖維支架材料對骨髓基質細胞(BMSCs)增殖及分化特點的影響，評價其作為骨組織工程的支架材料的應用前景.方法:將兔BMSCs與PCL電紡纖維支架材料在培養(yǎng)板內共培養(yǎng).采用形態(tài)學觀察、MTT法及ALP檢測等方法檢測BMSCs在PCL電紡纖維表面的粘附、增殖和分化能力.結果:體外培養(yǎng)的BMSCs能在PCL電紡纖維表面正常粘附和增殖，并且表達較高的堿性磷酸酶活性.結論:PCL電紡纖維適合作為支架材料應用于BMSCs為種子細胞的組織構建.【關鍵詞】電紡纖維;聚己內酯;骨髓基質細胞　　0引言　　理想

2、的組織工程支架材料要求其不但能夠作為種子細胞體內擴增和增殖的支架，而且應當能夠成為生長因子、生物活性物質和基因的生物載體，發(fā)揮細胞功能調節(jié)的作用［1］.目前已有近百種聚合物成功的通過這一技術獲取了超細纖維并被陸續(xù)應用于膜技術、增強材料、紡織品、光學傳感器、醫(yī)藥釋放體系以及組織工程支架材料制備等諸多領域［2］.本研究旨在通過聚己內酯（polycaprolactone,PCL）電紡纖維支架材料對兔骨髓基質細胞（bonemarroalcells,BMSCs）生長、增殖和功能分化作用的研究，初步探討PCL電紡纖維作為組織工程支架材料的應用前景.　　1材料和方法　　1．1材料聚己內酯（PCL

3、，美國Sigma公司，Mn=80000）；二甲基甲酰胺（DMF，西安化學試劑公司）；氯仿（西安化學試劑公司）；BGG40/2高壓直流電源(北京機電研究所，030KV)；JSM6700F型掃描電鏡(日本JEOL公司)；BX60型熒光顯微鏡(日本Olympus公司)；酶聯免疫檢測儀（美國BioTek公司）；1.5mo齡新西蘭幼兔1只，雄性，體質量1.5kg(第四軍醫(yī)大學實驗動物中心)；DMEM培養(yǎng)液（美國GibcoBRL公司）；胎牛血清（浙江金華清湖犢牛利用研究所）；胰蛋白酶（上海浦東生化試劑廠）；MTT（美國Sigma公司）；PholloidinFITC（美國Sigma公司）

4、；堿性磷酸酶(alkalinePhosphatase，ALP)檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）.　　1.2方法　　1.2.1PCL電紡纖維支架的制備以氯仿/DMF（體積比2∶1）的混合溶液為溶劑，配制濃度為80g/L的PCL電紡絲溶液.將電紡絲溶液加入一個安裝有8號不銹鋼注射針頭的自制玻璃加樣管.針頭即噴絲口與BGG40/2高壓直流電源的正極相連，針頭下方安裝一個接地的銅板，上覆鋁箔作為纖維的接收屏與高壓直流電源的負極相連.在外加電壓10kV，接收距離12cm，電紡絲溶液流量為3mL/h的條件下進行靜電紡絲.收集接收屏表面獲得的縱橫交錯的無紡纖維氈，置于干燥器中干燥保存.　　1

5、.2.2兔BMSCs的原代培養(yǎng)與接種取新西蘭幼兔四肢長骨，縱行剖開，DMEM培養(yǎng)液沖洗骨髓腔，靜置后取上清進行培養(yǎng)BMSCs.24h后換液，去除未貼壁的血細胞.每3d換液1次，2.5g/L胰酶常規(guī)消化傳代，倒置顯微鏡下觀察.取第二代生長良好的BMSCs，胰酶消化傳代.實驗分組為PCL電紡纖維實驗組和細胞培養(yǎng)板對照組兩組.將傳代培養(yǎng)的第二代BMSCs以4×104/cm2濃度接種于各組，每孔加入500μL接種細胞液，置入細胞培養(yǎng)箱4h，再加入500μL培養(yǎng)液，50mL/LCO2,飽和濕度、37℃繼續(xù)培養(yǎng).　　1.2.3肌動蛋白actin直接免疫熒光染色培養(yǎng)8h后取出PCL電紡纖維試件，

6、PBS沖洗3遍.37mL/L甲醛的PBS溶液固定5min,PBS洗滌2遍.丙酮脫水，1mL/LTritonX100滲透5min.10mg/LPholloidinFITC37℃孵育染色40min，抗熒光淬滅液封片.于365nm熒光顯微鏡下觀察記錄.　　1.2.4掃描電鏡觀察于培養(yǎng)3d后取出PCL電紡纖維試件，PBS沖洗3遍，25mL/L戊二醛固定24h.乙腈梯度脫水，10g/L鋨酸處理1h，臨界點干燥，離子濺射儀噴金.導電膠固定，以冷場發(fā)射掃描電子顯微鏡觀察，電子加速率為5kV.　　1.2.5MTT檢測于培養(yǎng)1，3，5，7d后向實驗各組分別加入2.5g/L胰蛋白酶消化3min，然

7、后加入含100mL/L胎牛血清的DMEM終止消化.500g離心10min，每管重新加入DMEM培養(yǎng)液200μL，接種至96孔培養(yǎng)板.每組4孔，每孔加入5g/L的MTT溶液20μL，37℃孵育4h.在酶聯免疫檢測儀上測各孔A490nm值，每組3個試件.　　1.2.6ALP活性檢測培養(yǎng)的第3，7,14日后，向實驗各組分別加入2.5g/L胰蛋白酶消化3min，然后加入含100mL/L胎牛血清的DMEM終止消化.將每個樣本的細胞懸液加入離心管，500g離心10min.每管加入