聚己內(nèi)酯電紡纖維支架材料對骨髓基質(zhì)細胞增殖及分化的影響

《聚己內(nèi)酯電紡纖維支架材料對骨髓基質(zhì)細胞增殖及分化的影響》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在應(yīng)用文檔-天天文庫。

1、聚己內(nèi)酯電紡纖維支架材料對骨髓基質(zhì)細胞增殖及分化的影響【摘要】目的：觀察聚己內(nèi)酯電紡纖維支架材料對骨髓基質(zhì)細胞(BMSCs)增殖及分化特點的影響，評價其作為骨組織工程的支架材料的應(yīng)用前景.方法:將兔BMSCs與PCL電紡纖維支架材料在培養(yǎng)板內(nèi)共培養(yǎng).采用形態(tài)學(xué)觀察、MTT法及ALP檢測等方法檢測BMSCs在PCL電紡纖維表面的粘附、增殖和分化能力.結(jié)果:體外培養(yǎng)的BMSCs能在PCL電紡纖維表面正常粘附和增殖，并且表達較高的堿性磷酸酶活性.結(jié)論:PCL電紡纖維適合作為支架材料應(yīng)用于BMSCs為種子細胞的組織構(gòu)建.【關(guān)鍵詞】電紡纖維;聚己內(nèi)酯;骨髓基質(zhì)

2、細胞0引言理想的組織工程支架材料要求其不但能夠作為種子細胞體內(nèi)擴增和增殖的支架，而且應(yīng)當(dāng)能夠成為生長因子、生物活性物質(zhì)和基因的生物載體，發(fā)揮細胞功能調(diào)節(jié)的作用［1］.目前已有近百種聚合物成功的通過這一技術(shù)獲取了超細纖維并被陸續(xù)應(yīng)用于膜技術(shù)、增強材料、紡織品、光學(xué)傳感器、醫(yī)藥釋放體系以及組織工程支架材料制備等諸多領(lǐng)域［2］.本研究旨在通過聚己內(nèi)酯電紡纖維支架材料對兔骨髓基質(zhì)細胞生長、增殖和功能分化作用的研究，初步探討PCL電紡纖維作為組織工程支架材料的應(yīng)用前景.1材料和方法1．1材料聚己內(nèi)酯；二甲基甲酰胺；氯仿；BGG40/2高壓直流電源(北京機電研究

3、所，030KV)；JSM6700F型掃描電鏡(日本JEOL公司)；BX60型熒光顯微鏡(日本Olympus公司)；酶聯(lián)免疫檢測儀；齡新西蘭幼兔1只，雄性，體質(zhì)量(第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心)；DMEM培養(yǎng)液；胎牛血清；胰蛋白酶；MTT；PholloidinFITC；堿性磷酸酶(alkalinePhosphatase，ALP)檢測試劑盒.方法電紡纖維支架的制備以氯仿/DMF的混合溶液為溶劑，配制濃度為80g/L的PCL電紡絲溶液.將電紡絲溶液加入一個安裝有8號不銹鋼注射針頭的自制玻璃加樣管.針頭即噴絲口與BGG40/2高壓直流電源的正極相連，針頭下

4、方安裝一個接地的銅板，上覆鋁箔作為纖維的接收屏與高壓直流電源的負極相連.在外加電壓10kV，接收距離1cm，電紡絲溶液流量為mL/h的條件下進行靜電紡絲.收集接收屏表面獲得的縱橫交錯的無紡纖維氈，置于干燥器中干燥保存.兔BMSCs的原代培養(yǎng)與接種取新西蘭幼兔四肢長骨，縱行剖開，DMEM培養(yǎng)液沖洗骨髓腔，靜置后取上清進行培養(yǎng)后換液，去除未貼壁的血細胞.每d換液1次，/L胰酶常規(guī)消化傳代，倒置顯微鏡下觀察.取第二代生長良好的BMSCs，胰酶消化傳代.實驗分組為PCL電紡纖維實驗組和細胞培養(yǎng)板對照組兩組.將傳代培養(yǎng)的第二代BMSCs以4×104/cm2濃度

5、接種于各組，每孔加入500μL接種細胞液，置入細胞培養(yǎng)箱h，再加入500μL培養(yǎng)液，50mL/LCO2,飽和濕度、37℃繼續(xù)培養(yǎng).肌動蛋白actin直接免疫熒光染色培養(yǎng)h后取出PCL電紡纖維試件，PBS沖洗3遍.mL/L甲醛的PBS溶液固定min,PBS洗滌2遍.丙酮脫水，1mL/LTritonX100滲透min.10mg/LPholloidinFITC7℃孵育染色40min，抗熒光淬滅液封片.于36nm熒光顯微鏡下觀察記錄.掃描電鏡觀察于培養(yǎng)d后取出PCL電紡纖維試件，PBS沖洗3遍，2mL/L戊二醛固定2h.乙腈梯度脫水，10g/L鋨酸處理1

6、h，臨界點干燥，離子濺射儀噴金.導(dǎo)電膠固定，以冷場發(fā)射掃描電子顯微鏡觀察，電子加速率為kV.檢測于培養(yǎng)1，3，5，d后向?qū)嶒灨鹘M分別加入/L胰蛋白酶消化min，然后加入含100mL/L胎牛血清的DMEM終止消化.00g離心10min，每管重新加入DMEM培養(yǎng)液200μL，接種至96孔培養(yǎng)板.每組4孔，每孔加入g/L的MTT溶液20μL，37℃孵育h.在酶聯(lián)免疫檢測儀上測各孔A490nm值，每組3個試件.活性檢測培養(yǎng)的第3，7,14日后，向?qū)嶒灨鹘M分別加入/L胰蛋白酶消化min，然后加入含100mL/L胎牛血清的DMEM終止消化.將每個樣本的細胞懸液加

7、入離心管，500g離心10min.每管加入200μL細胞裂解液，充分吹打混合.轉(zhuǎn)移至96孔培養(yǎng)板，加入mL/LTritonX1000μL，4℃過夜.采用ALP檢測試劑盒，每孔加入ALP反應(yīng)底物100μL，37℃孵育30min./LNaOH0μL終止反應(yīng)，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測各孔A410nm值，每組3個試件.統(tǒng)計學(xué)處理：數(shù)據(jù)以x±s表示，采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS進行方差分析.結(jié)果.1形態(tài)學(xué)觀察接種h后BMSCs在PCL電紡纖維材料表面的actin直接免疫熒光染色,BMSCs細胞以梭形和長方形為主，邊緣有弧度，胞質(zhì)豐滿、偽足伸展充分.細胞胞質(zhì)內(nèi)含大量束狀

8、排列的微絲結(jié)構(gòu)，向兩端伸展，排列有序.核周圍染色加深，呈圓形或卵圓形的細胞核(圖1).掃描電鏡下示BMSCs