三種誘導(dǎo)骨再生膜的構(gòu)建及其誘導(dǎo)成骨能力的比較.doc

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1、三種誘導(dǎo)骨再生膜的構(gòu)建及其誘導(dǎo)成骨能力的比較作者：姜文學(xué)，曹現(xiàn)林，徐東明，胡茂忠，尤佳，孫洪范'　摘要:目的制備PLGA-bBMP，PLGA-bBMP-IGF-Ⅱ，PLGA-bBMP-IGF-Ⅱ-bFGF三種誘導(dǎo)骨再生膜并比較其修復(fù)兔橈骨骨缺損的效果，探討其作用機(jī)制。方法將IGF-Ⅱ，bFGF和bBMP，分別與PLGA復(fù)合成具有生物活性的三種誘導(dǎo)骨再生膜，用其修復(fù)兔橈骨骨缺損，以單純PLGA膜作為對照組，分別在2、4、8周進(jìn)行大體、組織形態(tài)學(xué)、四環(huán)素示蹤和組織形態(tài)計(jì)量學(xué)觀察骨缺損的修復(fù)情況，并作統(tǒng)計(jì)

2、學(xué)分析;免疫組織化學(xué)檢測三種生長因子存在時(shí)間。結(jié)果提取的小牛骨bBMP能誘導(dǎo)成骨，三種誘導(dǎo)骨再生膜均能在體內(nèi)誘導(dǎo)新骨的形成，明顯優(yōu)于PLGA（對照組），其誘導(dǎo)效果呈現(xiàn)PLGA/bBMP（B組）　　1材料與方法　　1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物昆明小鼠10只（北京動(dòng)物所），鼠齡1.5個(gè)月，體重25～28g。日本大耳白兔27只（天津?qū)嶒?yàn)動(dòng)物中心），兔齡5個(gè)月，體重2.0～3.0kg?！　?.2bBMP提取及肌袋誘導(dǎo)成骨試驗(yàn)參照Urist方法［5］提取新鮮小牛長骨的bBMP，將提取bBMP凍干粉埋植于12只小鼠左下肢肌肉

3、內(nèi)，5mg/只;右下肢為對照側(cè)，模擬手術(shù)注射生理鹽水。于植入術(shù)后1、2、3周切取局部組織，HE染色觀察?！　?.3三種誘導(dǎo)骨再生膜的制備將90mg/mL的PLGA三氯甲烷溶液，在載玻片上流沿成膜，室溫?fù)]發(fā)15min，得到PLGA膜;用一定方法分別依次將5mg的bBMP，40活性單位IGF-Ⅱ和5μgbFGF吸附在PLGA膜上，室溫?fù)]發(fā)24h至干燥，得到PLGA/bBMP，PLGA/bBMP+IGF-Ⅱ，PLGA/BMP+IGF-Ⅱ+bFGF三種膜，塑料袋封裝，環(huán)氧乙烷消毒備用。掃描電鏡觀察膜表面微觀

4、結(jié)構(gòu)?！　?.4建立動(dòng)物模型和實(shí)驗(yàn)分組27只日本大耳白兔，隨機(jī)分3組，每組9只，按文獻(xiàn)方法［6］建立雙前肢橈骨10mm節(jié)段性骨缺損模型，植入三種誘導(dǎo)骨再生膜（見圖1），一側(cè)為實(shí)驗(yàn)組，另一側(cè)為對照組。單純PLGA膜作為對照組（A組），實(shí)驗(yàn)組分為B組:PLGA/bBMP;C組:PLGA/bBMP+IGF-Ⅱ;D組:PLGA/bBMP+IGF-Ⅱ+bFGF。分別于2、4及8周處死，通過大體觀察、Giemsa組織學(xué)染色、四環(huán)素?zé)晒鈽?biāo)記［7］及組織計(jì)量學(xué)分析［8］，結(jié)果采用方差分析。　　圖1誘導(dǎo)骨再生膜管安放

5、位置（略）　　1.5外源性生長因子的免疫組化檢測免疫組化采用SP法，DAB方法顯色，蘇木精復(fù)染，中性樹膠封固。PBS代替Ⅰ抗作為陰性對照。兔抗人IGF-Ⅱ抗體（Sigma）工作濃度為1∶125，兔抗牛BMP（Sigma）工作濃度為1∶300，兔抗人bFGF（Sigma）工作濃度為1∶500。2、4、8周時(shí)，分別對PL-GA組和PLGA/bBMP+IGF-Ⅱ+bFGF組的組織切片經(jīng)二甲苯脫脂，梯度乙醇脫水后行免疫組化染色，呈棕褐色顆粒為陽性。6　　2結(jié)果　　2.1PLGA/bBMP膜的表面微結(jié)構(gòu)觀察掃

6、描電鏡觀察結(jié)果顯示，PLGA/bBMP膜未見孔隙，表面粘附了生長因子后，膜的一側(cè)形成珊瑚狀粗糙面（見圖2），另一側(cè)呈光滑面?！　D2誘導(dǎo)骨再生膜掃描電鏡（略）　　2.2bBMP的骨誘導(dǎo)活性局部解剖觀察:bBMP植入后1周時(shí)植入?yún)^(qū)出現(xiàn)小結(jié)節(jié)團(tuán)塊，質(zhì)稍硬;2周時(shí)植入?yún)^(qū)內(nèi)結(jié)節(jié)漸增大，淡黃色，質(zhì)較硬，與周圍肌肉組織界限不清;3周時(shí)結(jié)節(jié)處骨化，形成硬質(zhì)骨，有白色骨皮質(zhì)和少許紅色似骨髓樣物質(zhì)，與股骨不連，新生骨體積大約0.5cm×0.4cm×0.3cm。對照側(cè)均未發(fā)現(xiàn)新骨形成?！　〗M織學(xué)觀察:bBMP植入7d時(shí)

7、植入?yún)^(qū)可見大量間充質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞增生，并向其周肌間隙浸潤性生長，肌纖維被分割成條索狀，間充質(zhì)細(xì)胞肥大，胞核增大，并開始向軟骨細(xì)胞分化，軟骨細(xì)胞從周圍向中央逐漸成熟，部分區(qū)域可見孤立的軟骨島，可見未成熟的前軟骨細(xì)胞;第14天植入?yún)^(qū)包塊內(nèi)出現(xiàn)陷窩樣特征的軟骨細(xì)胞和新生骨，細(xì)胞周圍形成軟骨基質(zhì)，新生軟骨為彈性軟骨樣特征，肌肉組織中新骨明顯可見，鈣化的骨樣組織呈藍(lán)色，見髓腔形成;第21天可見骨基質(zhì)形成和不規(guī)則的骨髓腔出現(xiàn)，新骨增多，有骨小梁及骨髓形成?！　?.3誘導(dǎo)骨再生膜的骨修復(fù)功能　　2.3.1PL

8、GA誘導(dǎo)骨再生膜（A組）Giemsa染色:術(shù)后2周PLGA膜完整，膜管外結(jié)締組織大量增生，對膜管形成嚴(yán)密包裹（見圖3a）;4周時(shí)缺損區(qū)內(nèi)間充質(zhì)細(xì)胞保持增殖活躍狀態(tài)，形成條狀軟骨（見圖3b）;8周時(shí)膜管內(nèi)骨缺損已被新生骨所連接，膜外形成少量骨痂，但生長方向紊亂（見圖3c）。熒光鏡下:術(shù)后2周缺損區(qū)內(nèi)骨小梁表面可見模糊的熒光線（見圖4a）;4周可見連續(xù)的雙標(biāo)記線（見圖4b）;8周缺損區(qū)內(nèi)可見多條粗大的雙標(biāo)記熒光線，骨小梁增多（見圖4c）?！　D3PLGA組的Giemsa染