血清白球蛋白的分離純化及鑒定1010課件

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1、血清白蛋白、γ-球蛋白的分離、純化及鑒定目的要求(一)掌握分離純化蛋白質(zhì)的基本原理。(二)了解柱層析技術(shù)。分工合作鹽析混勻時需要兩個人合作。色譜柱專人收集洗脫液，專人檢測樣品是否流出。脫鹽、純化兩次操作類似，都有動手的機會。操作一、鹽析－－白蛋白、γ球蛋白的粗分離<1>取0.5ml血清<2>取0.5ml飽和(NH４)２SO４溶液，緩慢滴入，邊加邊搖（？）。<3>混勻后于室溫中放置10min。（一）分離純化的意義①從生物材料中分離制備蛋白質(zhì)、核酸，研究其結(jié)構(gòu)與功能，對于了解生命活動的規(guī)律，闡明生命現(xiàn)象的本質(zhì)有重大意義。②工業(yè)生產(chǎn)的需要：食品、發(fā)酵、紡織、制革等工業(yè)

2、，需要大量的高活性的酶制劑。如用淀粉酶制造葡萄糖、麥芽糖、糊精以及糖漿等。③醫(yī)療的需要：如用豬胰島素治療糖尿病。④基因工程的需要常用的蛋白質(zhì)分離純化技術(shù)溶解度鹽析、等電點沉淀、有機溶劑沉淀分子大小透析、超過濾密度梯度離心、凝膠過濾帶電特性電泳、離子交換層析吸附特性吸附層析對配體分子的親和性依據(jù)性質(zhì)方法用于粗分用于細分親和層析、金屬螯合層析一、鹽析（中性鹽沉淀）在溶液中加入中性鹽使生物大分子沉淀析出的過程稱為“鹽析”。除了蛋白質(zhì)和酶以外，多肽、多糖和核酸等都可以用鹽析法進行沉淀分離。鹽析法的優(yōu)點：①成本低，不需要特別昂貴的設(shè)備。②操作簡單、安全。③對許多生物活性物質(zhì)具

3、有穩(wěn)定作用。鹽析的基本原理蛋白質(zhì)水溶膠的穩(wěn)定因素：水化膜和電荷。中性鹽的親水性大于蛋白質(zhì)分子的親水性。破壞水化膜，暴露出疏水區(qū)域，中和電荷，破壞親水溶膠溶解度鹽濃度Salting-outSalting-in++++++++++++++++等點電時的蛋白質(zhì)（親水膠體）帶負(fù)電荷蛋白質(zhì)（親水膠體）脫水脫水脫水帶負(fù)電荷蛋白質(zhì)（疏水膠體）不穩(wěn)定蛋白顆粒陰離子陽離子堿酸酸蛋白質(zhì)聚集沉淀帶正電荷蛋白質(zhì)（親水膠體）堿++水化膜帶正電荷蛋白質(zhì)（疏水膠體）中性鹽的選擇常用的中性鹽：(NH4)2SO41)溶解度大：0℃20℃80℃100℃（NH4)2SO470.675.495.3103N

4、a2SO44.918.943.342.2NaH2PO41.67.893.8101硫酸銨在0℃時的溶解度，遠遠高于其它鹽類2)分離效果好：有的提取液加入適量硫酸銨鹽析，一步就可以除去75％的雜蛋白，純度提高了四倍。3)不易引起變性，有穩(wěn)定酶與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的作用。有的酶或蛋白質(zhì)用2～3mol/L濃度的（NH4）2SO4保存可達數(shù)年之久。4)價格便宜，廢液不污染環(huán)境。分段鹽析不同的蛋白質(zhì)分子，由于其分子表面的極性基團的種類、數(shù)目以及排布的不同，其水化層厚度不同，故鹽析所需要的鹽濃度也不一樣，因此調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的中鹽濃度，可以使不同的蛋白質(zhì)分別沉淀。血清球蛋白清蛋白(NH4)2S

5、O450%飽和度飽和析出析出1)清蛋白等電點是4.0，α2球蛋白等電點是5.06，β球蛋白等電點是5.1，γ球蛋白等電點是7.1。2)清蛋白的分子量遠小于球蛋白色譜法chromatography脫鹽和純化——石油醚（流動相M）植物葉子的石油醚萃取液(樣本)碳酸鈣（固定相S）玻璃管（色譜柱）胡蘿卜素、葉黃素和葉綠素A、B連續(xù)色帶（色譜）1906年俄國植物學(xué)家米哈伊爾.茨維特一．基本概念色譜法：利用混合物中各組分的理化性質(zhì)的差異（吸附力、溶解度、分子形狀和大小、分子極性、分子親和力、電荷等），使各組分以不同程度分布在兩個相中，其中一個相叫固定相，另一個相流過此固定相叫流

6、動相。由于各組分受流動相作用產(chǎn)生的推力和受固定相作用產(chǎn)生的阻力不同，使各組分產(chǎn)生不同的移動速度，從而使結(jié)構(gòu)上具有微小差異的各組分得到分離的過程，稱之為色譜法。二．特點1、高效能2、高度選擇性3、高靈敏度4、操作簡單不足之處：定量精確，但定性較差色譜三、色譜的種類氣相色譜液相色譜氣－液色譜氣－固色譜液－液色譜液－固色譜1、吸附色譜法2、分配色譜法3、離子交換色譜法4、凝膠色譜法5、親和色譜法按原理分類二、脫鹽（凝膠層析法）透析——只用于除鹽類和小分子雜質(zhì)超過濾——除小分子雜質(zhì)，分離、濃縮蛋白質(zhì)加壓蛋白質(zhì)溶液半透膜支持膜的柵板超濾液凝膠層析又叫分子篩層析。具備條件：1惰

7、性，2水不溶性，3能高度水化。常用分子篩：葡聚糖凝膠（Sephadex）型號：G200、G150、G100、G75、G50、G25、G15分離大蛋白質(zhì)、小蛋白質(zhì)，除鹽瓊脂糖凝膠（瑞典Sepharose、美國Bio-GelA）孔徑大，用于分離大分子物質(zhì)聚丙烯酰胺凝膠（Bio-GelP）原理：1、分子量大的物質(zhì)不能進入凝膠粒子內(nèi)部，隨洗脫液從凝膠粒子之間的空隙擠落下來，所以大分子物質(zhì)遷移速度快；2、小分子物質(zhì)要通過凝膠網(wǎng)孔進入凝膠粒子內(nèi)部，所以小分子物質(zhì)遷移速度慢。離子交換色譜（ionexchangechromatography）以離子交換劑為固定相，利用樣品中不同