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《抗創(chuàng)傷弧菌mAb的制備與鑒定.doc》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、抗創(chuàng)傷弧菌mAb的制備與鑒定【摘要】 目的：制備抗創(chuàng)傷弧菌mAb并用于創(chuàng)傷弧菌感染的快速診斷.方法：用滅活創(chuàng)傷弧菌免疫Balb/c小鼠，采用雜交瘤技術(shù)制備抗創(chuàng)傷弧菌的mAb,ELISA法用于mAb的Ig效價,亞類及特異性鑒定.結(jié)果：獲得了2株可持續(xù)分泌抗創(chuàng)傷弧菌mAb的雜交瘤細(xì)胞株.結(jié)論：獲得的高特異性的抗創(chuàng)傷弧菌mAb不僅為創(chuàng)傷弧菌感染的快速診斷奠定了堅實的基礎(chǔ),而且為其進(jìn)一步的治療方面的研究提供了理論依據(jù).【關(guān)鍵詞】弧菌創(chuàng)傷抗體單克隆雜交瘤 【Abstract】AIM：Topreparemonoclonalantibody(mAb)againstVibriovulnific
2、usandevaluateitsrolesinrapiddiagnosisforVibriovulnificusinfection.METHODS：Balb/cmicewereimmunizedbyinactivedVibriovulnificus.Anti-VibriovulnificusMcAbswerepreparedbyusinghybridomatechnique.TheELISAwasusedtoidentifyIgsubgroup,titersofascites,relativeaffinityandthespecificityofMcAbs.RESULTS：Twoc
3、elllinesofhybridomawereestablishedandtheyconstantlysecretedhighqualityMcAbssteadily.CONCLUSION：TheMcAbsestablishedcouldbehighlyspecificforVibriovulnificus,whichnotonlylaysasolidfoundationfordevelopmentofarapidmethodfordetectionofVibriovulnificusinfectionbutalsoprovidesthetheoreticalbasisforfur
4、therinvestigationofthetreatment． 【Keywords】vibriovulnificus;antibodies,monoclonal;hybridomas 0引言 創(chuàng)傷弧菌是一種嗜鹽弧菌，存在于海水中，廣泛存在于海水及海產(chǎn)品中.人體可通過生食海鮮或經(jīng)過肢體破損創(chuàng)口接觸海水、海產(chǎn)品而受其感染［1-3］，見于海上勞作的漁民及駐海演習(xí)人員，常見的是發(fā)生下肢創(chuàng)傷弧菌感染所致的膿毒血癥，以及敗血癥引起的內(nèi)毒素性休克.創(chuàng)傷弧菌發(fā)病特點起病急,死亡率高［4-6］.因此，快速準(zhǔn)確的創(chuàng)傷弧菌早期診斷是指導(dǎo)臨床正確用藥從而達(dá)到理想治療效果的有力保證；同時，目前對于創(chuàng)
5、傷弧菌的治療手段仍為經(jīng)驗性的抗生素應(yīng)用［6-7］.然而，隨著細(xì)菌對抗生素逐漸出現(xiàn)的不同程度的耐藥現(xiàn)象，找到一種非大劑量應(yīng)用抗生素的治療感染也成為亟待解決的問題.mAb用于疾病的診斷及治療已在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到廣泛開展，并收到了很好的效果.作為我國海域主要致病菌之一的創(chuàng)傷弧菌，至今未見有診斷與治療的mAb制劑問世，為了解決該菌感染的診斷及防治問題，本研究對其mAb進(jìn)行了研究. 1材料和方法 1.1材料4實驗所用創(chuàng)傷弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株由第四軍醫(yī)大學(xué)解剖學(xué)與組織胚胎學(xué)教研室黃威權(quán)教授惠贈.骨髓瘤細(xì)胞Sp2/O由本室保存.Balb/c小鼠，雌性，6～8周齡，體質(zhì)量18～20g，購自第四軍醫(yī)大學(xué)實驗
6、動物中心.HRP-羊抗鼠IgG購自華美生物工程公司.Ig亞類鑒定試劑盒購自Sigma公司. 1.2方法 1.2.1抗創(chuàng)傷弧菌mAb的制備以10mL/L甲醛溶液滅活創(chuàng)傷弧菌為免疫原，初次免疫后3,5wk再次免疫，最后一次免疫的第3日取脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞Sp2/O進(jìn)行融合，間接ELISA法篩選陽性克隆后，有限稀釋法進(jìn)行克隆化，腹水的制備采用常規(guī)方法［7］. 1.2.2mAb的鑒定①效價測定:將甲醛滅活過的創(chuàng)傷弧菌菌液稀釋至1×1011個/L包被酶標(biāo)板，分別加入不同濃度稀釋的腹水，孵育后加入HRP-羊抗鼠IgG，最后加入OPD顯色后，H2SO4終止反應(yīng)后測A492nm值.實驗中以
7、免疫的小鼠血清為陽性對照，正常小鼠血清為陰性對照.②Ig亞類鑒定利用Sigma公司Ig亞類鑒定試劑盒檢測2株陽性雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)上清.③相對親和力檢測用滅活的創(chuàng)傷弧菌菌液以10mg/L包被酶標(biāo)板，加入倍比稀釋的mAb，孵育后加入HRP-羊抗鼠IgG，OPD顯色，H2SO4終止反應(yīng)后測A492nm值，繪出2條反應(yīng)曲線，以每條曲線上部平坦段（抗原抗體結(jié)合平臺期）的A值作為100％，然后以曲線上取得50％A值時的相對應(yīng)抗體濃度用于比較mAb相對親和力.④與其他常見魚病致病菌
