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《創(chuàng)傷弧菌溶血素基因的高效表達(dá)與鑒定》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫(kù)。
1、創(chuàng)傷弧菌溶血素基因的高效表達(dá)與鑒定作者：魏杰作者單位：蘭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生毒理學(xué)教研室，甘肅蘭州【摘要】?jī)械模簶?gòu)建創(chuàng)傷弧菌溶血素基因(vvc)的融合表達(dá)載體，并實(shí)現(xiàn)創(chuàng)傷弧菌溶血素在大腸桿菌中的高效表達(dá).方法：用一對(duì)創(chuàng)傷弧菌溶血素基因特異性引物從創(chuàng)傷弧菌基因組DNA中釣取vvc基因，TA克隆后測(cè)定核甘酸序列，構(gòu)建pET32a(+)-vvc融合表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物行SDSPAGE并進(jìn)行WesternBlot鑒定.結(jié)果：構(gòu)建了pET32a(+)vvc融合表達(dá)載體，DNA測(cè)序證明，獲得的vvc基因長(zhǎng)度為1311bp,與GenBank中報(bào)道的創(chuàng)傷
2、弧菌溶血素基因序列完全一致.SDSPAGE分析表明,vvc融合蛋口Mr為71X103,其表達(dá)量約占菌體總蛋白的32%.Westernblot結(jié)果顯示，0的蛋白可與創(chuàng)傷弧菌免疫后的小鼠血清特異性結(jié)合.結(jié)論：成功地實(shí)現(xiàn)了VVC基因在大腸桿菌中的高效表達(dá)，為進(jìn)一步研究vvc蛋白的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ).【關(guān)鍵詞】弧菌，創(chuàng)傷，溶血素類(lèi)，基因表達(dá)0引言創(chuàng)傷弧菌(Vibriovulnificus,Vv)自然存在于近海和海灣的海水和海底沉積物中[1],人體感染后病情發(fā)展迅速，最終發(fā)展為感染性休克、多器官衰竭而死亡，死亡率高達(dá)70%[2].創(chuàng)傷弧菌溶血素(Vibriovulnificuscytolysin,
3、vvc)的活性高達(dá)81000溶細(xì)胞單位(HU/mg),給實(shí)驗(yàn)小鼠尾靜脈注射毫克級(jí)以下水平的vvc就可以引發(fā)死亡［3］.體外實(shí)驗(yàn)研究表明，vvc對(duì)肥大細(xì)胞［4］、紅細(xì)胞［5］等哺乳動(dòng)物的細(xì)胞都可以產(chǎn)生顯著的細(xì)胞毒性作用，但其確切的致病機(jī)制還不十分清楚.本研究構(gòu)建了pET32a(+)vvc原核表達(dá)系統(tǒng)，采用創(chuàng)傷弧菌全菌抗體對(duì)融合蛋白進(jìn)行鑒定，為今后創(chuàng)傷弧菌快速診斷試劑盒的制備及VVC基因表達(dá)調(diào)控機(jī)理和功能研究奠定基礎(chǔ).1材料和方法1.1材料1.1.1菌種、載體與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物創(chuàng)傷弧菌、溶藻弧菌、副溶血性弧菌為海軍總醫(yī)院檢驗(yàn)科實(shí)驗(yàn)室保存菌種;大腸桿菌DH5A、BL21(DE3)、原核表達(dá)載體pET3
4、2a(+)以及BALB/c小鼠均來(lái)自木實(shí)驗(yàn)室.1.1.2工具酶與主要試劑PCR試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、凝膠冋收試劑盒、溶菌酶Lysozyme、DNA和蛋白質(zhì)Marker均為北京天根試劑公司產(chǎn)品;限制性?xún)?nèi)切酶BamHI和HindIII、T4DNA連接酶和pGEMTEasy購(gòu)于Promega公司.1.2方法1.2.1細(xì)菌活化將創(chuàng)傷弧菌菌株按1：100接種于預(yù)先預(yù)熱至37°C的LB培養(yǎng)基中，37°C220r/min振搖培養(yǎng)6h,以待備用.1.2.2模板制備取1.5mL活化菌液于13000g離心2min,徹底倒盡上清液，用雙蒸水洗滌一次，13000g離心2min,去上清,將菌體懸浮，蓋上蓋子，在
5、沸水中煮5min,13000g離心5min,將上清儲(chǔ)存在-20°C,取2~4ML進(jìn)行PCR.123引物設(shè)計(jì)根據(jù)GenBank公布的創(chuàng)傷弧菌VVC基因核昔酸序列和內(nèi)切酶圖譜分析結(jié)果口行設(shè)計(jì)含有合適內(nèi)切酶位點(diǎn)的特異性引物?vvc引物序列：上游5’CGCGGATCCCAAGAATATGTGCCGATTGTT3’(BamHI),下游5'CCCAAGCTTGAGTTTGACCTGTTGTAATGT3'(HindIII),送上海生工生物公司合成.1.2.4PCR反應(yīng)PCR反應(yīng)總體積為25ML,引物濃度為10Mmol/L,50ngDNA模板?PCR反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性5min;94°C變性30s
6、;58°C復(fù)性45s;72°C延伸1min共30個(gè)循環(huán);72°C繼續(xù)延伸10min?待反應(yīng)結(jié)束后，取5ML擴(kuò)增產(chǎn)物于10g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物.1.2.5vvc基因的純化與回收按照DNA膠回收試劑盒操作說(shuō)明，從瓊脂糖電泳中將目的條帶切下，用膠冋收試劑盒冋收純化PCR產(chǎn)物.1.2.6TA克隆、測(cè)序與表達(dá)載體的構(gòu)建應(yīng)用TA克隆試劑盒，將擴(kuò)增的目的片斷克隆至pGEMT載體，轉(zhuǎn)化于E.coliDH5A感受態(tài)細(xì)胞中37°C過(guò)夜培養(yǎng)，在平板上挑取單個(gè)菌落，進(jìn)行PCR鑒定，獲得滿(mǎn)意測(cè)序結(jié)果后，通過(guò)質(zhì)粒提取試劑盒小量制備質(zhì)粒pGEMTvvc和pET32a(+),利用BamHI和Hindlll
7、分別進(jìn)Jiff行雙酶切，回收酶切產(chǎn)物，在T4DNA連接酶作用下將vvc基因酶切片段與pET32a(+)酶切產(chǎn)物16°C連接過(guò)夜，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET32a(+)vvc,連接后轉(zhuǎn)化于E.coliBL21(DE3),擴(kuò)增、提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切后再次測(cè)序，測(cè)序結(jié)果用NCBI中的Blast軟件分析.127重組質(zhì)粒pET32a(+)vvc在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)挑取經(jīng)酶切鑒定的原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a(+)vvc單菌落，培養(yǎng)至A600nm=0.5時(shí)
