醫(yī)藥學(xué)臨床醫(yī)學(xué)畢業(yè)論文 急性早幼粒細(xì)胞白血病患者微小殘留病的檢測與臨床意義的研究

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1、湖南師范大學(xué)本科畢業(yè)論文考籍號(hào)：XXXXXXXXX姓名：XXX專業(yè)：醫(yī)藥學(xué)臨床醫(yī)學(xué)論文題目：急性早幼粒細(xì)胞白血病患者微小殘留病的檢測與臨床意義的研究指導(dǎo)老師：XXX二〇一一年十二月十日作者:任海全，唐天華，畢可紅，張玉昆，趙良玉，郭桂月，劉秀蘭，姜楓勤，劉傳芳，彭軍，田志剛［摘要］目的檢測完全緩解后急性早幼粒細(xì)胞白血病患者微小殘留病(MRD)，同時(shí)分析其對預(yù)后判斷的指導(dǎo)價(jià)值。方法建立逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT/PCR)用以檢測APL患者PML/RARα。結(jié)果RT-PCR方法敏感而可重復(fù)。治療前APL患者的RT-PCR陽性率為92.8%(39/42)，而維甲酸

2、或化療誘導(dǎo)完全緩解后MRD陽性率為56.7%(21/37)。另外，MRD陽性與緩解后APL患者的復(fù)發(fā)有關(guān)，并可以作為緩解后預(yù)測APL患者復(fù)發(fā)的指標(biāo)。同時(shí)有助于指導(dǎo)臨床上采取鞏固治療而防止復(fù)發(fā)。結(jié)論RT-PCR能夠檢測APL患者的MRD和作為預(yù)測復(fù)發(fā)的指標(biāo)。［關(guān)鍵詞］急性早幼粒細(xì)胞白血?。晃⑿埩舨。籖T/PCR白血病患者完全緩解（CR）后的微小殘留?。∕RD）已被證實(shí)與復(fù)發(fā)有關(guān)［1］。MRD的檢測也成為指導(dǎo)緩解后進(jìn)一步化療的重要指標(biāo)［2］。在目前血液病的應(yīng)用實(shí)踐中，MRD檢測的最好例子是骨髓移植后RT-PCR法檢測慢性粒細(xì)胞白血?。–ML）的BCR-

3、ABL融合基因［3］。急性早幼粒細(xì)胞性白血病（APL）以特異的染色體t（15;17）（q22;q21）易位為特征［4］。最近，許多實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)t（15;17）易位后，通過15染色體上的PML基因和17染色體上的RARα基因并列而導(dǎo)致融合基因PML/RARα形成［5］。根據(jù)PML斷裂點(diǎn)的位置不同，可以產(chǎn)生2個(gè)主要的PML/RARα異構(gòu)體。斷裂點(diǎn)位于PML內(nèi)含子3或4（bcr3），則PML外顯子3（P3）和RARα外顯子3（r3）之間形成短（S）型融合mRNA產(chǎn)物，而斷裂點(diǎn)位于PML內(nèi)含子6（bcr1）或下游，PML內(nèi)含子6（P6）和RARα外顯子（r3）

4、形成長（L）型融合體［6，7］。RT-PCR法的建立正是依賴于斷裂點(diǎn)的位置而設(shè)計(jì)適當(dāng)寡核苷酸引物，繼而擴(kuò)增PML/RARαmRNA異構(gòu)體［8］。另外，RT-PCR的高度敏感性使得MRD的檢測成為可能，并可在APL患者臨床緩解期時(shí)早期預(yù)測白血病的復(fù)發(fā)。1資料與方法1.1病例選擇本研究中的42例患者均為1993～2000年發(fā)病，男26例，女16例，年齡12～72歲，根據(jù)FAB標(biāo)準(zhǔn)［9］診斷為APL。全部病例均經(jīng)全反式維甲酸（ATRA）治療［30～60mg/（m2·d）］誘導(dǎo)緩解。鞏固化療方案為標(biāo)準(zhǔn)的HOAP或DA方案。鞏固治療后處于緩解期的患者采用全國維

5、甲酸協(xié)作治療組建議的ATRA與化療聯(lián)合治療方案維持治療［10］。骨髓單個(gè)核細(xì)胞用Ficoll分離并保存于液氮中。1.2RNA提取10ml淋巴細(xì)胞分離液加于試管中，然后2ml骨髓細(xì)胞緩慢加入試管中，離心4000r/min20min。取單個(gè)核細(xì)胞移入另一試管中，再用異硫氫酸胍-酚-氯仿一步法抽提RNAs［11］。提取時(shí)注意避免樣品間的交叉污染。1.3筑巢式RT-PCR檢測APL的PML/RARα檢測方法：8個(gè)寡核苷酸引物用于逆轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增，檢測其長或短型異構(gòu)體。逆轉(zhuǎn)錄引物：A5-TGGATGCTGCGGCGGAAGAAGCCCTTGCAG-3PML/R

6、ARα引物：B5-GTCATAGGAAGTGAGGTCTTC-3C5-CCGATGGCTTCGACGAGTTC-3D5-CTCACAGGCGCTGACCCCAT-3E5-AACAGCAACCACGTGGCCAG-3F5-TTCAAGGTGCGCCTGCAGGA-3G5-AGCCTGAGGACTTGTCCTGA-3H5-GCTGCTCTGGGTCTCAAT-3正常RARα轉(zhuǎn)錄引物：I5-GCCTCCCTACGCCTTCTTCTTCT-3J5-AAAGCAAGGCTTGTAGATGC-3K5-GACCACTCTCCAGCACCA-3L5-GCTG

7、GGCACTATCTCTTCAGAACT-3RT-PCR方法與步驟按照早期報(bào)道的方法進(jìn)行［12］。1.4PCR產(chǎn)物分析取10μl第2輪PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠1μg/ml染色，照相。并移至尼龍膜上，用5末端寡核苷酸探針（H）雜交，放射自顯影30min，拍片。1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用t檢驗(yàn)。2結(jié)果2.1PCR產(chǎn)物的結(jié)果及其敏感度PML/RARα的L、S異構(gòu)型（見圖1）。RT-PCR的敏感度為2.5×10-6。圖1PML/RARα類型2.2RT-PCR陽性百分率用全反式維甲酸治療前APL患者PML/RARα的檢測，34例為L型陽性，5例

8、為S型陽性。L型、S型或2型的總陽性百分率分別為80.9%（34/42）、11.9%（5/42）和92.8%